Development of tools for metagenomic analysis of viruses

Οι ιοί αποτελούν τις πιο άφθονες και ποικιλόμορφες βιολογικές οντότητες στη Γη, ακροβατώντας στα όρια μεταξύ του έμβιου και του άβιου, ενώ λειτουργούν ως βαθιές κινητήριες δυνάμεις της εξέλιξης, αλλά και ως υπαίτιοι παράγοντες παγκόσμιων ασθενειών. Ενώ η παραδοσιακή ιολογία περιοριζόταν για μεγάλο χρονικό διάστημα από μεθόδους που εξαρτώνταν σε κυτταροκαλλιέργειες ιών, η εμφάνιση της Αλληλούχισης Επόμενης Γενιάς (Next-Generation Sequencing - NGS) στις αρχές του 21ου αιώνα έφερε επανάσταση στον τομέα μέσω της ιικής μεταγονιδιωματικής. Αυτή η αμερόληπτη ολιστική προσέγγιση, ανεξάρτητη από δοκιμές κυτταροκαλλιέργειας ιών, επιτρέπει την ανάκτηση του συνολικού ιικού φορτίου—του ιώματος (virome)— απευθείας από βιολογικά δείγματα. Εντός αυτού του ευρύτερου πλαισίου, η μεταγονιδιωματική των RNA ιών (ή μετα-μεταγραφωματική) έχει καταστεί ολοένα και πιο κρίσιμη και συχνά προτιμάται έναντι στρατηγικών που βασίζονται στο DNA, καθώς οι RNA ιοί αποτελούν τα κυρίαρχα παθογόνα και συμβιωτικά στοιχεία των ευκαρυωτικών ξενιστών, οδηγώντας την ταχεία εξέλιξη, τη ρύθμιση των οικοσυστημάτων και τη δυναμική των παγκόσμιων ασθενειών. Δεδομένου ότι τα αιματοφάγα αρθρόποδα έντομα λειτουργούν ως πρωταρχικές δεξαμενές και φορείς για την πλειονότητα αυτών των RNA ιών, ο χαρακτηρισμός του ιώματός τους είναι απαραίτητος για την πρόβλεψη αναδυόμενων απειλών. Ωστόσο, οι τρέχουσες προσεγγίσεις —που συχνά περιορίζονται σε μελέτες ενός είδους ή σε δεξαμενές μικτών ταξινομικών ομάδων— στερούνται της διακριτικής ικανότητας να καθορίσουν με σαφήνεια το πολύπλοκο δίκτυο αλληλεπίδρασης ιών-φορέων ενός εξεταζόμενου οικοσυστήματος. Αντιμετωπίζοντας αυτόν τον περιορισμό υπό το πλαίσιο της «Ενιαίας Υγείας» (One Health), η παρούσα μελέτη προτείνει και θέτει σε εφαρμογή μια ολιστική προσέγγιση επιτήρησης για την αναγνώριση της ζωτικής διασύνδεσης μεταξύ της ανθρώπινης, ζωικής και περιβαλλοντικής υγείας. Πραγματοποιήσαμε έναν ολοκληρωμένο χαρακτηρισμό των RNA ιωμάτων που καλύπτουν 24 είδη κουνουπιών και 10 είδη σκνιπών (Culicoides) από το οικοσύστημα Ανατολικής Μακεδονίας και Θράκης της Ελλάδας — μια στρατηγική βιογεωγραφική πύλη για την ανταλλαγή ιών μεταξύ Ασίας και Ευρώπης. Η έρευνα αυτή ταυτοποίησε συνολικά 48 ιικά είδη, εκ των οποίων τα 29 είναι νέα, και απέδειξε ότι οι πληθυσμοί ξενιστών διατηρούν ποιοτικά και ποσοτικά σταθερούς «ιικούς πυρήνες» (core viromes), χαρτογραφώντας έτσι με επιτυχία το προηγουμένως ασαφές γεωχωρικό δίκτυο αλληλεπιδράσεων ιών-φορέων. Αν και οι προσεγγίσεις NGS έχουν φέρει επανάσταση στην ιολογία, η μεταγονιδιωματική των RNA ιών παραμένει σε μεγάλο βαθμό εξαρτώμενη από τη λεγόμενη Δεύτερη Γενιά ή Αλληλούχιση Μικρών Αναγνώσεων (Short-Read Sequencing - SRS) λόγω της καθιερωμένης ακρίβειας και της οικονομικής αποδοτικότητάς της. Παρ' όλα αυτά, η απόπειρα ανάλυσης του συνολικού RNA ιικού φορτίου των εξεταζόμενων αιματοφάγων εντόμων της παρούσας μελέτης, αποκάλυψε ένα συστημικό τεχνικό εμπόδιο, εγγενές σε αυτή την ευρέως διαδεδομένη τεχνολογία. Αναμφίβολα, οι ροές εργασίας SRS εξαρτώνται από πρωτόκολλα πολλών σταδίων που περιλαμβάνουν Αντίστροφη Μεταγραφή (Reverse Transcription) ή ενίσχυση μέσω Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction - PCR), τα οποία αποτελούν κύριες πηγές τεχνητών χιμαιρικών αναγνώσεων (chimeric reads). Αυτά τα τεχνουργήματα, συγκεκριμένα οι λανθασμένες συντήξεις μεταξύ ιικών και μη ιικών αλληλουχιών, ιδιαίτερα βακτηριακού ή ριβοσωμικού RNA (rRNA) του ξενιστή, επιμένουν ακόμη και μετά από τυπικά πρωτόκολλα απομάκρυνσης και καταλήγουν να απορρίπτονται από τα υπάρχοντα βιοπληροφορικά εργαλεία, οδηγώντας στην απώλεια ανεκτίμητης ιικής πληροφορίας. Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, αναπτύξαμε το υπολογιστικό εργαλείο Viral Reads Assembly Enhancer (ViRAE), μια εξελιγμένη και αναθεωρημένη έκδοση του πιλοτικού αλγορίθμου «Zero-Waste Algorithm» (ZWA) του εργαστηρίου μας. Διαχωρίζοντας τη θέση του από τις τρέχουσες βιοπληροφορικές μεθόδους αιχμής, το ViRAE χρησιμοποιεί έναν επιλεκτικό μηχανισμό εκτομής βάσει νουκλεοτιδικής στοίχισης, ώστε να αφαιρεί «χειρουργικά» μόνο τα μη ιικά τμήματα. Αυτή η καινοτόμος προσέγγιση επιτρέπει την «ανακύκλωση» των υπόλοιπων ιικών τμημάτων για βελτιστοποιημένη de novo συναρμολόγηση καθοδικά. Μέσω μιας διεξοδικής συγκριτικής ανάλυσης μεγάλης κλίμακας σε 528 δημοσιευμένα δεδομένα RNA-seq από εμπλουτισμένες πηγές, τα οποία σχετίζονταν με καθιερωμένα στελέχη ιών αναφοράς που χρησιμοποιούνται ως «χρυσός κανόνας» στο πεδίο, το ViRAE επέδειξε στατιστικά σημαντική ανώτερη απόδοση στην ποιότητα και τη συνοχή της de novo συναρμολόγησης (p < 0.0001) σε σύγκριση τόσο με μεθόδους χειρισμού ακατέργαστων αναγνώσεων όσο και με τυπικές τεχνικές φιλτραρίσματος μη ιικών αναγνώσεων. Πέρα από τις στατιστικές μετρήσεις, αυτή η βελτίωση απέδωσε πραγματικά βαθιά βιολογική σημασία, καθώς σε μια πιλοτική εφαρμογή του ViRAE σε πιο απαιτητικά μεταγονιδιωματικά δεδομένα RNA-seq χαμηλής αφθονίας που συνδέονται με δημοσιευμένα de novo συναρμολογημένα ιικά μεταγονιδιώματα, καταφέραμε να γεφυρώσουμε με επιτυχία γονιδιωματικά κενά και να αποκαταστήσουμε κρίσιμους φυλογενετικούς δείκτες που προηγουμένως ήταν κατακερματισμένοι ή χαμένοι σε συνολικά 107 ιικά μεταγονιδιώματα. Συνεπώς, η παρούσα διατριβή εκπληρώνει έναν διπλό στόχο: τον καθορισμό ενός ολιστικού παραδείγματος για την έρευνα της ιικής μεταγονιδιωματικής και τη μηχανική των ισχυρών βιοπληροφορικών εργαλείων που απαιτούνται για την υποστήριξή της. Ενσωματώνοντας την οικολογική ανακάλυψη με την ισχυρή βιοπληροφορική καινοτομία, η εργασία αυτή καθιερώνει ένα ολοκληρωμένο πλαίσιο που διασφαλίζει την ακεραιότητα των ιικών γονιδιωματικών πόρων.