Αξιολόγηση των μικρών μορίων RNA ως βιοδεικτών στην χρόνια Ηπατίτιδα Β

Εισαγωγή: Παγκοσμίως περίπου 240 εκατομμύρια άνθρωποι πάσχουν από χρόνια ηπατίτιδα Β. Τις περισσότερες φορές η χρόνια νόσος είναι καλά ελεγχόμενη, λόγω της θεραπευτικής αγωγής με νουκλεοσιδικά ανάλογα (NΑs), τα οποία μπλοκάρουν την ιική δραστηριότητα του ιού και συμβάλλουν αποτελεσματικά στην σταθεροποίηση της νόσου. Ωστόσο, πολλές φορές όταν η θεραπεία με τα NAs διακόπτεται μπορεί να οδηγήσει σε αναζωπύρωση της νόσου, με την σταδιακή ανάπτυξη, είτε κίρρωσης, είτε ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (ΗΚΚ). Συνήθως τα NAs αποτελούν εσαεί θεραπεία της χρόνιας ηπατίτιδας Β, χωρίς να προβλέπεται ο τερματισμός τους . Έτσι λοιπόν η εύρεση ενός έμμεσου διαγνωστικού δείκτη, τόσο για την αξιολόγηση, όσο και για τον τερματισμό της θεραπείας με τα NAs μπορεί να φανεί χρήσιμη. Ένας δείκτης που ανιχνεύεται στην κυκλοφορία και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως έμμεσος δείκτης της μεταγραφικής δραστηριότητας του HBV είναι το pregenomic RNA (pgRNA). Το pgRNA αποτελεί εκμαγείο για την έκφραση της reverse transcriptase (RT) και των core πρωτεϊνών, ενώ μέσω της αντίστροφης μεταγραφής δίνει την αρνητική αλυσίδα του rcDNA. Το pgRNA μαζί με την HBV poly και τις core πρωτεΐνες συσκευάζεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο σε ώριμα Dane λοιμογόνα σωματίδια. Μελέτες χρήσης του HBV pgRNA ως δείκτη αξιολόγησης της χρόνιας ηπατίτιδας Β δείχνουν πως η χρήση του μπορεί να προβλέψει ικανοποιητικά την έκβαση της νόσου . Επιπλέον, η παθοφυσιολογία του μικροπεριβάλλοντος του ήπατος σε καταστάσεις χρόνιας νόσου αποτελεί πεδίο που δεν έχει χαρακτηριστεί επαρκώς, αφήνοντας κενά σχετικά με την δράση της έμφυτης ανοσίας ενώ ταυτοχρόνως φαίνεται πως η επικράτηση δυσλειτουργικών T-λεμφοκυττάρων ευθύνεται για την χρόνια φλεγμονή. Ωστόσο, κύτταρα της πρώτης γραμμής άμυνας, όπως τα ουδετερόφιλα μπορούν επίσης να επιδεινώσουν την ίνωση. Τα ουδετερόφιλα εκκρίνοντας χυμειοεκλυτικούς παράγοντες προσέρχονται στο μικροπεριβάλλον της φλεγμονής μέσω διήθησης και αλληλεπιδρούν με άλλα κύτταρα του ηπατικού μικροπεριβάλλοντος. Ένα από αυτά τα κύτταρα είναι το αιμοπετάλιο το οποίο ασκεί επουλωτική δράση μέσω της θρόμβωσης, ωστόσο σε περιπτώσεις φλεγμονής φαίνεται πως το φαινόμενο της ανοσοθρόμβωσης εντείνεται προκαλώντας τον πολλαπλασιασμό των ηπατικών stellate cells (HSCs), επιδεινώνοντας την ίνωση. Λαμβάνοντας υπόψιν την έλλειψη βιβλιογραφίας σχετικά με το φλεγμονώδες προφίλ της χρόνιας ηπατίτιδας Β και την συμβολή του αιμοπεταλίου σε αυτήν, σκοπός της διδακτορικής αυτής εργασίας είναι να διερευνήσει το μεταγραφωμικό προφίλ των ασθενών με χρόνια ηπατίτιδα Β και να το αξιολογήσει με γνώμονα την έμφυτη ανοσία και τις κυτταρικές αλληλεπιδράσεις αιμοπεταλίου-ουδετερόφιλου, όσον αφορά τον ορολογικό δείκτη HBV pgRNA. Υλικά και Μέθοδοι: Συνολικά μελετήθηκαν 88 χρόνιοι ασθενείς με ηπατίτιδα B αρνητικοί για το HBeAg και υπό θεραπεία με NAs. Τα δείγματα που συλλέχθηκαν ήταν πλάσμα το οποίο ελέγχθηκε για όλους τους βιοχημικούς και ιολογικούς δέικτες του ιού, καθώς και για το HBV pgRNA μέσω της μεθόδου rt PCR. Στην συνέχεια, προσδιορίστηκε ο γονότυπος του ιού και πραγματοποιήθηκε αλληλούχηση 8 δειγμάτων. Όλοι οι ασθενείς ήταν αρνητικοί για το HBV DNA, οι 4 από αυτούς ήταν θετικοί για το HBV pgRNA, ενώ οι υπόλοιποι αρνητικοί γι’ αυτό. Τα δεδομένα αυτά αναλύθηκαν με τα βιοπληροφορικά εργαλεία: TrimGalore, fastp, Hisat2, HTseq, samtools, DESeq2, pheatmap, VennDiagram και ggplot2. Έπειτα, προσδιορίστηκαν τα μονοπάτια έκφρασης των διαφορικώς εκφραζόμενων γονιδίων (|log2FC| ≥ 1 και p.adjusted < 0.05) με την βοήθεια της GSEA ανάλυσης που πραγματοποιήθηκε με τα βιοπληροφορικά εργαλεία: clusterProfiler και τις βάσεις δεδομένων GO (Gene Ontology) και KEGG (Kyoto Encyclopedia for Gene and Genome). Τα παραπάνω βήματα πραγματοποιήθηκαν για δύο διαφορετικές αναλύσεις. Στην πρώτη ανάλυση συγκρίθηκαν οι χρόνιοι ασθενείς μεταξύ τους και με μία ομάδα υγιών για την παρουσία HBV pgRNA, ενώ στην δεύτερη ανάλυση αντλήθηκαν δεδομένα από ασθενείς με HBV-σχετιζόμενο HKK από την μελέτη GSE57381 και συγκρίθηκαν η χρόνια κατάσταση της νόσου με αυτήν του ΗΚΚ και της ομάδας ελέγχου. Από τις παραπάνω αναλύσεις βρέθηκαν κοινά μονοπάτια για τα οποία οργανώθηκαν πειραματικές διατάξεις, όπως η ενεργοποίηση αιμοπεταλίων με τον ορό των χρόνιων ασθενών θετικών και αρνητικών για το HBV pgRNA. Επιπλέον, μελετήθηκε και η αλληλεπίδραση τους με τα ουδετερόφιλα και πραγματοποιήθηκαν και στους δύο πληθυσμούς διαδικασίες ανοσοφθορισμού και rt PCR για τον προσδιορισμό των ιντερλευκινών IL-1b, IL-17A, του αντιμικροβιακού πεπτιδίου LL-37 και των πρωτεϊνών της αυτοφαγίας BECLIN-1, LC3-B, και P62. Τέλος, προσδιορίστηκαν και αξιολογήθηκαν για όλα τα δείγματα οι δείκτες FIB-4 και PAGE-B για την πορεία της κίρρωσης και τον κίνδυνο ανάπτυξης HKK, αντίστοιχα. Η στατιστική ανάλυση και η δημιουργία των προγνωστικών μοντέλων έγιναν με την βοήθεια των SPSS 26.0 και της R, όπου για όμοιες διακυμάνσεις χρησιμοποιήθηκε το Student’s t-test, ενώ σε αντίθετη περίπτωση το Mann-Whitney U test. Αποτελέσματα: Το ποσοστό των χρόνιων ασθενών που βρέθηκαν θετικοί στο HBV pgRNA ήταν 18,1%. Τα ποσοτικά επίπεδα του HBV pgRNA εμφανίζουν στατιστικά σημαντική θετική σχέση με τους δείκτες ALT, AST, HBV DNA, HBsAg, INR, ενώ αυτά σχετίζονται αρνητικά με την διάρκεια της θεραπείας. Ασθενείς με προχωρημένο ινωτικό στάδιο (Ishak ≥2) εμφάνισαν μικρότερη πιθανότητα ανίχνευσης του HBV pgRNA κατά τη διάρκεια της θεραπείας σε σύγκριση με ασθενείς με ήπια ίνωση σύμφωνα με το προγνωστικό μοντέλο FIB-4. Όσον αφορά την πρώτη μεταγραφωμική ανάλυση καταλήξαμε σε 916 διαφορικώς εκφραζόμενα γονίδια από τα οποία τα κοινά γονίδια μεταξύ των ομάδων HBV pgRNA-θετικών και HBV pgRNA-αρνητικών είναι 197. Από τα κοινά αυτά γονίδια φαίνεται να προκύπτουν μονοπάτια συμμετοχής τους σε κυτταρικές διεργασίες όπως η αυτοφαγία και ο πρωτεϊνικός έλεγχος ορθής αναδίπλωσης, μονοπάτια ρύθμισης του RNA, αλλά και μονοπάτια ενεργοποίησης αιμοπεταλίων και της έμφυτης ανοσίας, όπως η αποκοκκίωση των ουδετεροφίλων. Στην δεύτερη ανάλυση βρέθηκαν 3,215 διαφορικώς εκφραζόμενα γονίδια εκ των οποίων τα κοινά μεταξύ CHB και HBV-σχετιζόμενου ΗΚΚ είναι 329 υπερεκφραζόμενα και στις δύο ομάδες. Από την GSEA προέκυψαν μονοπάτια συμμετοχής τους σε κυτταρικές διαδικασίες βιογένεσης, όπως η αυτοφαγία, η αναστολή της απόπτωσης, ο μεταβολισμός του RNA και η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, καθώς και η αποκοκκίωση των ουδετερόφιλων, τα οποία φαίνεται να είναι κοινά με την πρώτη ανάλυση. Στην συνέχεια, η ύπαρξη του HBV pgRNA στον ορό αξιολογήθηκε για την συμμετοχή του στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και στην συνομιλία τους με τα ουδετερόφιλα. Στα αιμοπετάλια φαίνεται πως η παρουσία του HBV pgRNA ενεργοποιεί την αυτοφαγία, ενώ σε διατάξεις αλληλεπίδρασης με τα ουδετερόφιλα, φαίνεται να ενεργοποιείται ο προφλεγμονώδης φαινοτύπος. Συγκεκριμένα στα αιμοπετάλια παρατηρείται αύξηση των επιπέδων της LC3-Β υπό την παρουσία του HBV pgRNA, καθώς επίσης και της παραγωγής του αντιμικροβιακού πεπτιδίου LL-37. Ωστόσο, η μελέτη της δραστικότητάς του LL-37 δεν έδειξε ούτε αντιμικροβιακή, ούτε ινωτική δράση. Η συνδυαστική μελέτη της επικοινωνίας του αιμοπεταλίου με το ουδετερόφιλο έδειξε την ανάπτυξη προφλεγμονώδους φαινοτύπου μέσα από τα υψηλά επίπεδα της IL-1b στα ουδετερόφιλα. Ωστόσο, ενώ παρατηρήθηκε η έκφραση ουδετεροφιλικής ελεστάσης η ανίχνευσή της περιορίστηκε σε επίπεδο κυτταροπλάσματος αποδίδοντας έναν προνετωτικό φαινότυπο με ελάχιστες νετωτικές δομές στους HBV pgRNA-θετικούς. Επιπλέον, η απουσία έκφρασης της IL-17A στα ουδετερόφιλα, περιγράφει την απουσία ίνωσης, υποδεικνύοντας έτσι μία συντηρημένη προφλεγμονώδη κατάσταση στο ηπατικό μικροπεριβάλλον των χρόνιων ασθενών με ηπατίτιδα Β. Συμπεράσματα: Η μελέτη του HBV pgRNA ως έμμεσου δείκτη για τον τερματισμό της αντιικής θεραπείας φαίνεται πως μπορεί να χρησιμοποιηθεί και ως δείκτης αξιολόγησης της φλεγμονής στο ήπαρ σε ασθενείς σε χρόνια φάση. Η μελέτη του άξονα επικοινωνίας αιμοπετάλιο-ουδετερόφιλο έδειξε πως τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια στους χρόνιους ασθενείς έχουν την ικανότητα να αποκοκκιώνουν δραστικούς παράγοντες, χωρίς αυτοί να είναι άμεσα βιοενεργοί. Η χρήση του ουδετερόφιλου ως κυττάρου διαμεσολαβητή της δράσης του αιμοπεταλίου έχει δείξει πως υπάρχει μία αμφίδρομη αλληλεπίδραση μεταξύ τους. Αυτό που παρατηρήσαμε ήταν η ανάπτυξη προφλεγμονώδους κατάστασης στα ουδετερόφιλα μετά από διέγερση με ενεργοποιημένα αιμοπετάλια από ασθενείς που βρίσκονται σε χρόνια φάση. Έτσι φαίνεται να υπάρχει μία δυναμική προφλεγμονώδης κατάσταση, η οποία σταδιακά εξελίσσεται σε φλεγμονώδη και ινωτική σε ασθενείς με κίρρωση, όπως δείξαμε και σε πρόσφατη έρευνα. Συγκεκριμένα, η αδυναμία των αιμοπεταλίων να εξάγουν λειτουργικά μόρια LL-37, καθώς και η απουσία παραγωγής IL-17A σε συνδυασμό με την ύπαρξη IL-1b στα ουδετερόφιλα, αιτιολογούν την ύπαρξη ενός προφλεγμονώδους και όχι ινωτικού φαινοτύπου στους χρόνιους ασθενείς με θετικό HBV pgRNA. Τέλος, η προσπάθεια μας να συνδυάσουμε έναν ιικό δείκτη της μεταγραφικής δραστηριότητας του HBV με την εξέλιξη της νόσου έχει ανοίξει τον δρόμο για περαιτέρω μελέτη του άξονα αιμοπετάλιο-ουδετερόφιλο στην χρόνια νόσο, ωστόσο μένει να αποφανθούμε αν τελικά το HBV pgRNA είναι αυτός καθ’ αυτός ο δείκτης, που πυροδοτεί αυτήν την ενδοκυττάρια αλληλεπίδραση.