Identification and functional verification of new molecular targets of blood – cerebrospinal fluid and exosomes from patients with neurodegenerative diseases

Η νευρωνική εκφύλιση και δυσλειτουργία αποτελούν χαρακτηριστικά γνωρίσματα των νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Σήμερα, μια σημαντική πρόκληση για τους ερευνητές και τους κλινικούς ιατρούς είναι η ανάπτυξη αξιόπιστων διαγνωστικών εργαλείων που θα επιτρέπουν την έγκαιρη διάγνωση των νευροεκφυλιστικών ασθενειών, κατά προτίμηση στο προ συμπτωματικό στάδιο. Παρά τις δεκαετείς έρευνες και την έγκριση ορισμένων φαρμάκων από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων, η αναστολή της γνωστικής επιδείνωσης που σχετίζεται με τη νευροεκφύλιση παραμένει εξαιρετικά δύσκολη. Σήμερα, η διάγνωση της πλειονότητας των νευροεκφυλιστικών ασθενειών βασίζεται στην κλινική εξέταση και στις απεικονιστικές τεχνικές. Αν και οι διαταραχές αυτές προκύπτουν από διακριτούς παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς, μοιράζονται κοινούς βιοδείκτες από βιολογικά υγρά και αίμα, οι οποίοι συμβάλλουν στη διάγνωση και χαρακτηρισμό τους. Για αυτό το λόγο ο πρώτος στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι ο ποσοτικός προσδιορισμός επιλεγμένων πρωτεϊνικών βιοδεικτών στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) και στο αίμα (πλάσμα/ορός), με σκοπό την υποστήριξη της διαφορικής διάγνωσης διαφόρων νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Αρχικά, η μελέτη ξεκίνησε με την εφαρμογή μονοπλεκτικών δοκιμών του υποδοχέα του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (uPAR) σε περιορισμένη κοόρτη ασθενών με σποραδική νόσο Creutzfeldt-Jakob (sCJD), καθώς και των TAU, α-synuclein (α-syn) και YKL-40 (Chitinase 3-like 1) σε ευρύτερη κοόρτη ασθενών με συνουκλεϊνοπάθειες (νόσος Parkinson (PD), άνοια με σωμάτια Lewy (DLB) και ατροφία πολλαπλών συστημάτων (MSA)). Οι προκύπτουσες συγκεντρώσεις των βιοδεικτών αυτών παρουσίασαν έλλειψη ευαισθησίας και ειδικότητας, χωρίς διακριτά όρια διαχωρισμού (cutoff values), υπογραμμίζοντας την ανάγκη για μια πιο ακριβή πλατφόρμα ανοσοδοκιμασιών, με μεγαλυτερο εύρος ανίχνευσης, ικανή να επιτρέπει αποτελεσματική διάγνωση και διαφορική διάκριση μεταξύ των νοσημάτων.Για τον σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε η πολυπλεκτική πλατφόρμα SIMOA τεσσάρων βιοδεικτών (γλοιακή ινώδης όξινη πρωτεΐνη (GFAP), ελαφριά αλυσίδα των νευρονημάτων (NfL), TAU και υδρολάση L1 του καρβοξυ-τελικού άκρου της ουβικιτίνης (UCH-L1)), σε δύο διαφορετικές κλινικές κοόρτες. Η καμπύλη λειτουργικών χαρακτηριστικών του δέκτη (ROC curve analysis) και η επιφάνεια κάτω από την καμπύλη (AUC) αξιολόγησαν τη διαγνωστική ακρίβεια των υπό μελέτη βιοδεικτών στο ΕΝΥ και στο αίμα των ασθενών. Όσον αφορά ασθενείς με νόσο Alzheimer (AD) και μετωποκροταφική άνοια (FTD), ο βιοδείκτης με την καλύτερη διαγνωστική απόδοση ήταν ο UCH-L1 στο ΕΝΥ. Οι βέλτιστες τιμές διαχωρισμού εντοπίστηκαν στα >1260 pg/mL για AD και >1052 pg/mL για FTD, επιβεβαιώνοντας τη χρησιμότητα του UCH-L1 ως υποσχόμενου βιοδείκτη για τη διαφοροδιάγνωση αυτών των νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Η NfL στο ΕΝΥ έδειξε καλή διαγνωστική ακρίβεια για τη διάκριση ασθενών με AD και FTD από υγιείς μάρτυρες, με τιμή διαχωρισμού >688,8 pg/mL και >463,9 pg/mL, αντίστοιχα. Η TAU στο ΕΝΥ εμφάνισε τη δεύτερη καλύτερη απόδοση μετά το UCH-L1 για τη διάκριση των AD από μάρτυρες, με τιμή διαχωρισμού >137,0 pg/mL, ενώ έδειξε καλή ακρίβεια και στη διάκριση των AD από τους FTD. Επίσης, καλή διαγνωστική ικανότητα παρατηρήθηκε στη διάκριση FTD από μάρτυρες με τιμή διαχωρισμού >111,3 pg/mL. Τέλος, η GFAP στο ΕΝΥ παρουσίασε μετρίου βαθμού ακρίβεια στη διάκριση AD από ομάδα μαρτύρων με τιμή διαχωρισμού >5942 pg/mL. Αντίστοιχα, η GFAP στο πλάσμα και στο ΕΝΥ έδειξε μέτρια απόδοση στη διάκριση AD από FTD.Στη Σκλήρυνση κατά πλάκας (MS) και στο Kλινικά μεμονωμένο σύνδρομο (CIS), η NfL στον ορό και στο ΕΝΥ έδειξε μέτρια διαγνωστική ακρίβεια στη διάκριση των MS από CIS και μάρτυρες, με τιμές διαχωρισμού >5,909 pg/mL και >453,4 pg/mL, αντίστοιχα. Η TAU στον ορό ήταν ο βιοδείκτης με την καλύτερη απόδοση στη διάκριση CIS από μάρτυρες, με τιμή διαχωρισμού >0,5950 pg/mL, ενώ στο ΕΝΥ 0,5823 pg/mL και ΕΝΥ 48,08 pg/mL. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματά μας προσφέρουν νέα προοπτική και πληροφορίες για τους βιοδείκτες UCH-L1 και GFAP στην κοόρτη AD-FTD, καθώς και για τους NfL και TAU στην ομάδα MS, αναδεικνύοντας τον πιθανό ρόλο τους στη νευρωνική βλάβη, την αποδόμηση πρωτεϊνών και την εξέλιξη της νόσου. Δεύτερος στόχος της μελέτης, είναι η διερεύνηση του ρόλου των νευρωνικών εξωσωμάτων στην παθογένεση και εξάπλωση των νευροεκφυλιστικών ασθενειών (με έμφαση στη νόσο Prion). Για τον σκοπό αυτό αξιοποιήθηκε παθολογικό μοντέλο μυός RML (Εργαστήριο Rocky Mountain), το οποίο μας παρείχε πρόσβαση σε εξωκυτταρικά κυστίδια εμπλουτισμένα με εξωσώματα (ExE-EVs) εγκεφαλικής προέλευσης. Η μελέτη μας έδειξε ότι τα νευρωνικά εξωσώματα από υγιή και παθολογικά (Prion) ποντίκια, τόσο σε πρώιμο όσο και σε όψιμο στάδιο της νόσου, μοιράζονται κοινά χαρακτηριστικά, όπως διπλή μεμβράνη, κυπελλοειδές σχήμα, μέγεθος 50–200 nm και συγκέντρωση (σωματίδια/mL). H πρωτεομική ανάλυση αποκάλυψε 4337 πρωτεΐνες, εκ των οποίων οι 1272 βρέθηκαν διαφοροποιημένες μεταξύ Prion και ομάδας ελέγχου. Οι μεταβολές αυτές σχετίζονταν κυρίως με μιτοχονδριακή λειτουργία και ρυθμίσεις της μεμβράνης του ενδοπλασματικού δικτύου. Η Prion παθολογία αναδείχθηκε ως ένα από τα βασικά παθολογικά μονοπάτια στο σύνολο των υπό μελέτη δεδομένων, με 14 πρωτεΐνες να εμφανίζουν διαφοροποιήσεις στην έκφρασή τους μεταξύ υγιών και παθολογικών δειγμάτων. Ειδικότερα, η πρωτεΐνη-στόχος μας, PrP, εμφάνισε 16πλάσια αύξηση στο όψιμο στάδιο της νόσου Prion σε σύγκριση με τα υγιή ποντίκια. Συνολικά, η παρούσα διατριβή προσφέρει μία ολοκληρωμένη επισκόπηση των πρωτεϊνικών βιοδεικτών του ΕΝΥ, του αίματος και του εξωσωμικού υλικού σε διάφορες νευροεκφυλιστικές ασθένειες. Τα ευρήματα της μελέτης δύνανται να συμβάλουν ουσιαστικά στον τομέα της ανακάλυψης βιοδεικτών, ενισχύοντας την κατανόηση της παθοφυσιολογίας τους και των τιμών διαχωρισμού τους, με απώτερο σκοπό την έγκαιρη και αξιόπιστη διάγνωση, καθώς και τις θεραπευτικές παρεμβάσεις.