miR-99b-5p as a Modulator of KLF4 Expression and Drug Response in Luminal B Breast Cancer via a Ubiquitin-Mediated Mechanism

Objective: Luminal B breast cancer (BC) exhibits aggressive behavior and distinct molecular features, often leading to resistance to therapies such as trastuzumab and tamoxifen.MicroRNAs have emerged as key regulators of cancer progression and drug response.This study explores the role of miR-99b-5p in modulating treatment resistance in Luminal B BC.Methods: Both trastuzumab-sensitive BT-474 cells and trastuzumabresistant BT-474 cells were employed to evaluate the functional role of miR-99b-5p through mimic and inhibitor transfections.Gene and protein expression levels were measured using qRT-PCR and Western blotting, respectively.Bioinformatic analyses were performed using the ENCORI, UALCAN, GeneMiner, ROCplot, and UbiBrowser databases.Results: Our results demonstrated that miR-99b-5p expression was initially downregulated following tamoxifen or trastuzumab treatment, but was subsequently elevated in trastuzumab-resistant cells, suggesting a dynamic regulatory role in therapeutic adaptation.Bioinformatic analyses identified an association between miR-99b-5p and Kruppel-like factor 4 (KLF4), a zinc-finger transcription factor implicated in BC progression and therapy sensitivity.Biological assays provided evidence that miR-99b-5p positively regulates KLF4 and BCL2 protein levels, potentially promoting cell survival and contributing to drug resistance.Mechanistically, we identified TRAF7 as a downstream target of miR-99b-5p, and TRAF7 modulates KLF4 protein stability through ubiquitin-mediated degradation.Suppression of TRAF7 by miR-99b-5p reduces KLF4 ubiquitination, enhancing its stability and downstream signaling.Amaç: Luminal B tipi meme kanseri, artmış tümör agresifliği ve özgün moleküler özellikleriyle karakterize olup, trastuzumab ve tamoksifen gibi hedefe yönelik tedavilere karşı direnç gelişimiyle sıklıkla ilişkilidir.MikroRNA'lar (miRNA), kanser progresyonu ve tedavi yanıtının temel düzenleyicileri olarak öne çıkmaktadır.Bu çalışmada, miR-99b-5p'nin Luminal B meme kanserinde tedavi direncini düzenleyici rolü araştırılmıştır.Yöntemler: Trastuzumab'a duyarlı ve trastuzumab dirençli BT-474 meme kanseri hücrelerinde, miR-99b-5p'nin fonksiyonu, özgül mimik ve inhibitörler kullanılarak değerlendirilmiştir.Gen ve protein ekspresyon düzeyleri sırasıyla qRT-PCR ve Western blot yöntemleriyle analiz edilmiştir.Ayrıca, ENCORI, UALCAN, GeneMiner, ROCplot ve UbiBrowser gibi biyoinformatik veri tabanları aracılığıyla hedef genlerin ekspresyon profilleri ve tedavi cevabı ile ilişkisi incelenmiştir.Bulgular: miR-99b-5p ekspresyonu, tamoksifen veya trastuzumab uygulaması sonrasında ilaca duyarlı BT-474 hücrelerinde azalırken, trastuzumab dirençli hücrelerde artış göstermiştir; bu durum, terapötik adaptasyonda dinamik bir düzenleyici rolüne işaret etmektedir.Biyoinformatik ve deneysel analizler, miR-99b-5p'nin çinko parmak transkripsiyon faktörü (KLF4) ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur.Hücre temelli analizlerde miR-99b-5p'nin KLF4 ve BCL2 protein düzeylerini artırarak hücre sağkalımını desteklediği ve ilaç direncine katkıda bulunduğu gözlemlenmiştir.Mekanistik olarak, miR-99b-5p'nin hedeflediği TRAF7 olarak bilinen E3 ubikütin ligazın KLF4'ün ubikütinasyonu aracılı yıkımını düzenlediği; TRAF7'nin baskılanmasıyla KLF4 ubikütinasyonunun azaldığı ve protein stabilitesinin arttığı belirlenmiştir.