Biotechnologische Produktion und Scale-Up von rekombinanten Kollagen als Basismaterial für Bioprinting Anwendungen

Diese Arbeit untersucht die rekombinante Herstellung eines kollagenmimetischen Strukturproteins (ColMP) basierend auf der α1-Kette des humanen Kollagens Typ I in K. phaffii für den Einsatz als Biomaterial im Tissue Engineering mit besonderem Fokus auf die Anforderungen des Bioprintings. Für diese Anwendung muss das Protein klar definiert, biokompatibel und in ausreichender Menge verfügbar sein, da typische Bioinks etwa 10 % (w/v) des strukturgebenden Proteins erfordern. Im 30 L Bioreaktor konnte ColMP produziert werden, wobei nach membranbasierter Aufreinigung eine Ausbeute von 1,1 g L⁻¹ erzielt wurde. Das Protein zeigte jedoch zytotoxische Effekte, die auf Begleitkomponenten des methanolinduzierbaren AOX1-Systems zurückzuführen waren. Zwar ermöglichte eine Metallionenaffinitätschromatografie eine selektive Aufreinigung des Zielproteins, das sich in reiner Form als vielversprechendes Biomaterial erwies, doch war dieser Schritt mit erheblichen Verlusten verbunden. Dieses verdeutlicht die Notwendigkeit einer Prozessoptimierung zur Steigerung der Ausbeute und Reduktion Methanol-assoziierter Nebenproduktbildung im Upstream, sowie der Entfernung dieser störenden Bestandteile im Downstream, um die Wirtschaftlichkeit des Gesamtprozesses zu erhöhen. Zur Bewältigung dieser Herausforderungen wurden molekularbiologische Ansätze sowie verschiedene Kultivierungs- und Methanol-Feed Strategien evaluiert. Eine Supplementation mit Prolin erhöhte den Titer um 14,3 %, während ein Methanol unabhängiger GAP-Promotor keine nachweisbare Zielproteinexpression erzielte. In einem Multicopy-Screening basierend auf dem AOX1-Promotor zeigten Stämme mit niedriger Kopienzahl die beste Sekretion. Eine Zwei-Phasen Kultivierungsstrategie mit gradientenbasierter Methanolzugabe führte zur höchsten ColMP Konzentration und zu einer 11-fachen Steigerung der Zielproteinausbeute gegenüber der ursprünglichen Kultivierungsstrategie. Eine Drei-Phasen Strategie mit zusätzlicher Glycerin Fed-Batch Phase erhöhte zwar erwartungsgemäß die Biomasse, jedoch nicht die Zielproteinausbeute. Dieses zeigte, dass eine Maximierung der Zelldichte kein entscheidender Faktor für eine effiziente Proteinproduktion von ColMP ist. Stattdessen schien ein kontrolliertes Zellwachstum unter physiologisch optimalen Bedingungen entscheidend für eine hohe Proteinproduktivität zu sein. Eine Mixed-Feed Strategie mit dem Ziel, die methanolassoziierte Nebenproduktbildung zu minimieren, führte lediglich zu einem reduzierten Methanolverbrauch, bewirkte jedoch weder eine Steigerung der Produktausbeute noch eine Verringerung der Nebenprodukte. Die im Rahmen der Upstream-Optimierung erzielte Steigerung der Produktkonzentration erschwerte die zuvor standardmäßig eingesetzte Membranvorfiltration, während sich die Tiefenfiltration als effiziente und skalierbare Alternative ohne relevante Proteinverluste erwies. Ein Ultrafiltration Ansatz zur Nebenproduktentfernung führte hingegen zu einem Proteinverlust von 94 %, ohne dass unspezifische Bindungen an die verwendeten Membranmaterialien als Ursache bestätigt werden konnten. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, dass molekularbiologische Optimierungen in Kombination mit angepassten Feed Strategien die ColMP Expression um den Faktor 11 steigerten und damit eine vielversprechende Grundlage für die wirtschaftliche Bereitstellung kollagenbasierter Biomaterialien schaffen, auch wenn die Entwicklung robuster Downstream-Strategien weiterhin einen kritischen Prozessschritt darstellt.