NMR investigations of RNA and NMR Fragment-based screening of SARS-CoV-2 RNA and proteins

Ein Teilaspekt dieser Dissertation wendet sich der Untersuchung der Struktur und Dynamik eines RNA-Elementes in der 3'-untranslatierten Region (UTR) von SARS-CoV-2 zu: das engl. stem-loop 2 motif (s2m). S2m ist ein 41 Nukleotide langes, hochkonserviertes RNA-Element mit unbekannter Funktion, das nicht nur im SARS-CoV-2 Genom gefunden wurde, sondern auch in SARS-CoV-1 und vielen entfernt verwandten Viren identifiziert worden ist. Die 3D-Struktur von s2m in SARS-CoV-1 wurde im Jahr 2005 aufgeklärt und weist eine einzigartige strukturelle Faltung auf, insbesondere eine GNRA-ähnliche Schleife, engl. loop, aus fünf Nukleotiden, das durch ein GC-Quartett stabilisiert wird. NMR-spektroskopische Untersuchungen zur Bestimmung der Sekundärstruktur von SARS-CoV-2 RNA-Elementen zeigten jedoch eine Veränderung in der oberen Stammschleife, engl. stem-loop, von s2m in SARS-CoV-2. Im Vergleich zu SARS-CoV-1 traten in der SARS-CoV-2 s2m Sequenz Mutationen auf, wovon eine das GC-Quartett unterbrach und dazu führte, dass die RNA durch einen loop aus neun Nukleotiden anstelle eines loops aus fünf Nukleotiden geschlossen wurde. Im Verlauf der Pandemie entstanden Varianten wie die Delta-Variante, bei der die Mutation 29.742G zu 29.742U auftrat, die den oberen stem von s2m (zuvor eine G-A Fehlpaarung) stabilisierte. Dies ermöglichte eine umfassende strukturelle Charakterisierung dieser RNA in ihrer vollen Länge (s2m Delta) sowie einer kürzeren Version, der s2m Delta_short. Die s2m Delta RNA wurde mit NMR analysiert, und über 90% der strukturrelevanten chemischen Verschiebungsresonanzen wurden mit einer Kombination aus fortschrittlichen NMR-Experimenten zugeordnet. Mit der vollständigen Zuordnung konnten Ligandenbindungsstellen von Fragmenten aus einer später beschriebenen Screening-Kampagne in s2m Delta bestimmt werden. Diese Ergebnisse sind in der Publikation „NMR characterization and ligand binding site of the stem–loop 2 motif from the Delta variant of SARS-CoV-2” aufgeführt. Für die Untersuchung des loops aus neun Nukleotiden von s2m wurde ein verkürztes RNA-Konstrukt von s2m Delta hergestellt (s2m Delta_short), welches nur den oberen stem und den loop umfasste. S2m Delta_short wurde umfangreich zugeordnet und analysiert, um eine NMR-Struktur zu erhalten. Die Struktur konvergierte im stem Bereich, zeigte jedoch hohe mittlere quadratische Abweichungen, engl. root mean square deviation (RMSD) im loop. NMR-Experimente zur Aufklärung der Dynamik in der s2m Delta_short RNA, insbesondere der loop Nukleotide, wurden durchgeführt, wie Relaxationsexperimente zur Bestimmung der Rotationskorrelationszeit, heteronukleare NOEs und die Bestimmung der Zucker Konformationen durch kanonische Koordinaten, 3J-Kopplungen und kreuzkorrelierte Relaxationsraten, engl. cross-correlated relaxation rates (CCR). Die NMR-Untersuchungen deuteten auch auf ein G-U-loop-schließendes Basenpaar hin, was durch 13C, 15N-HSQC-Experimente bestätigt wurde. Eine weitere Charakterisierung der Dynamik im loop mithilfe von MD-Simulationen wurde in Zusammenarbeit mit der Forschungsgruppe von Jeffrey Evanseck in Pennsylvania, USA, durchgeführt. Dieser integrative NMR/MD-Ansatz ermöglichte die Durchführung einer CCR-basierten bayesian maximum entropy (BME)-Neugewichtung der 20 µs MD-Simulationen, aus denen zentrale Strukturen abgeleitet wurden. Es wurde eine Faltung mit einer geknickten Struktur gefunden, die der strukturell einzigartigen SARS-CoV-1-Faltung des loops ähnelte. Diese Ergebnisse sind in der Publikation „Structural heterogeneity and dynamics in the apical stem loop of s2m from SARS-CoV-2 Delta by an integrative NMR spectroscopy and MD simulation approach” aufgeführt. Der zweite Teilaspekt dieser Dissertation wendet sich dem NMR-basierten Fragment-basierten Screening-Ansatz (FBS) zu. Die Fragment-basierte Arzneimittelforschung ist eine in der Wissenschaft und Industrie angewandte Methode, bei der eine chemisch vielfältige Gruppe kleiner Moleküle (