Development of endocrine sensitive endpoints in fish

Hormonforstyrrende stoffer, herunder bisphenol A og visse bisphenol A alternativer, udgør en risiko for endokrin og neuroudviklings relaterede funktioner hos dyr. De nuværende regulatoriske vurderinger af hormonforstyrrende egenskaber i miljøet, bygger på dyreforsøg, så som Amphibian Metamorphosis Assay (AMA), mens vurderingen af udviklingsneurotoksicitet udelukkende bygger på gnaverstudier, designet til at beskytte human sundhed, hvilket efterlader en kritisk manglende beskyttelse af miljøet. I overensstemmelse med principperne for de 3R’er (Replacement, Reduction og Refinement) og EU’s forpligtigelse til at udfase dyreforsøg i toksikologisk testing, er udviklingen af ”New Approach Methodologies” (NAMs) blevet en prioritet. Ifølge EU-direktiv 2010/63/EU og kommunionens Implementing Decision 2012/707/EU betragtes dyr som ikke-beskyttede indtil begyndelsen af selvstændigt fødeindtag, hvilket hos zebrafisk sker fem dage efter befrugtning (dpf). Dette ph.d.-projekt har til formål at anvende zebrafisk-eleutheroembryoer som en NAM-model til vurdering af thyreoidea hormonsystem (THS) forstyrrende og udviklingsneurotoksiske egenskaber fra kemikalier. Det eksperimentelle arbejde er primært baseret på OECD Test Guideline (TG) 236, og TG 210, suppleret med thyreoidea hormon system (THS)-sensitive endpoints beskrevet i Adverse Outcome Pathway (AOP) 157 og AOP 364 samt udviklingsneurotoksiske endpoints. Zebrafisk eleutheroembryoer (5 dpf) og juvenile fisk (21-33 dpf) blev eksponeret for bisphenol A alternativer (bisphenol E, bisphenol AP, bisphenol S-MAE og kombineret eksponering, eller for methimezole (MMI), et velkendt thyreoidea forstyrrende stof. De undersøgte endpoints omfattede posteriore og anteriore svømmeblære inflation, øjenmorphologi (herunder retinal pigmentary epithelium (RPE) of inner plexiform layer (IPL)), svømmeadfærd i en Light/Dark Transitions Test (LDTT), transskriptionsniveauer af THS- og DNT relaterede gener (f.eks. tpo, dio1, dio2, dio3a, mbpa, syn2a), kvantitative målinger af morphologiske ændringer i hjernen (optisk tectum, telencephalon og samplet hjerneareal) med rygmarvens indgang til baghjernen som anatomisk referencepunkt, samt forløbelige immunohistokemisk farvning for T4 og T4 i eleutheroembryoer. Reproducerbarheden af LDTT blev evalueret gennem en multilaboratorie ring test, med indledende fokus på variationen blandt negative kontroller, men også med eksponeringsscenarier (koffein og 3,4-DCA) for fuld vurdering af reproducerbarheden. Dette ph.d.-projekt dokumenterer, at visse bisphenol A alternativer, såsom bisphenol E og bisphneol S-MAE, har potentiale til at forstyrre thyreoidea hormonsystemet, ligesom bisphenol A, mens andre såsom bisphenol AP, kun viste svage effekter på endpoints sensitive til thyreoidea hormonsystemet. Kombineret eksponering afslørede endpoint specifikke interaktioner. Bisphenol E og bisphenol SMAE virkede synergetisk på endpoints såsom øjenudviklings, mens de udviste additive eller antagonistiske effekter på svømmeadfærd og posteriore svømmeblære inflation. Eksponering for methimazol resulterede i en markant opregulering af tpo i både eleutheroembryoer og juvenile fisk, hvilket bekræftede forstyrrende af thyreoidea hormonsystemet i modellen. Desuden medførte TPOforstyrrelse betydelige hjernemorphologiske ændringer hos juvenile fisk, herunder reduktion af optisk tectum og samlet hjerneareal. Disse effekter kunne dog ikke påvises i eleutheroembryo-NAMmodellen, hvilket indikerer begrænset prædiktiv kapacitet for senere hjerneskader medieret af kemisk eksponering. På tværs af 15 laboratorier var svømmeadfærden hos negative kontroller meget ensartet, hvilket understøtter pålideligheden og robustheden af den standardiseret LDTT-protokol. Samlet set viser dette arbejde, at forstyrrelse af thyreoidea hormonsystemet kan drive udviklingsmæssige og neuroudviklingsmæssige effekter hos zebrafisk med livstadie-specifik følsomhed. Juvenile fisk er mere følsomme overfor at detektere TPO-forstyrrelse medierede hjerneskader, mens eleutheroembryoer giver værdifuld indsigt i thyreoidea hormonsystem sensitive udviklings endpoints, såsom posterior svømmeblæreinflation, øjenudvikling og svømmeadfærd. Dog er eleutheroembryoer ikke tilstrækkelige til at forudsige hjerneskader hos juvenile fisk under de testede betingelser. Den kvantitative hjernemorphologiske metode udviklet i dette ph.d.-projekt løfter hjernemorfologisk vurdering ud over semikvantitative scoringssystemer og muliggør robuste sammenligninger på tværs af individer. Dette ph.d.-projekt styrker anvendelsen af zebrafiske-eleutheroembryoer som en NAM-model til vurdering af thyreoidea hormonforstyrrende egenskaber fra kemikalier, introducerer en kvantitativ hjernemorfologisk tilgang til vurdering af hjerneskader forårsaget af kemikalier baseret på anatomiske referencepunkter, og bidrager til standardisering af adfærdsassays gennem LDTT.