Development of Endocrine Sensitive Endpoints in Invertebrates

Som følge af de stigende restriktioner på anvendelsen af bisphenol A (BPA) i f.eks. sutteflasker og kvitteringer på termisk papir samt mere generelt i fødevarekontaktmaterialer i Europa og Nordamerika har industrien udviklet molekyler, der strukturelt ligner BPA, kendt som BPAalternativer. Disse forbindelser anvendes nu i en lang række produkter, herunder gummi, flammehæmmere, termisk papir og kosmetik. Den stigende anvendelse har gjort BPAalternativer allestedsnærværende i dagligdagen, og deres tilstedeværelse er allerede blevet rapporteret i humane blod- og urinprøver, husstøv og drikkevand. Uundgåeligt er disse kemikalier blevet spredt i miljøet og er blevet påvist i jord, marine farvande og ferskvandsøkosystemer. Denne globale kontaminering udgør en potentiel trussel mod alle levende organismer, herunder hvirvelløse dyr. Da mere end 95% af alle kendte arter er hvirvelløse dyr, spiller disse organismer en central rolle i økosystemernes funktion. Blandt dem er bløddyr særligt udsatte, idet over 30% af de beskrevne arter er truet af udryddelse. Bløddyr er vigtige komponenter i fødenet og næringsstofkredsløb, og gastropoder udgør den største og mest truede gruppe. Det er derfor afgørende at vurdere og forstå virkningen af forurenende stoffer såsom BPA-alternativer for at opretholde bløddyrpopulationer og dermed økosystemernes sundhed. Ferskvandssneglen Lymnaea stagnalis er en veletableret modelorganisme inden for økotoksikologi, anvendt både i embryonale og voksne stadier, og tilbyder muligheder for udvikling af nye metodiske tilgange (NAMs), der kan erstatte forsøg med hvirveldyr. Den primære bekymring ved BPA-alternativer er, at deres strukturelle lighed med BPA kan føre til tilsvarende effekter, især deres evne til at fungere som hormonforstyrrende stoffer (EDCs). I manuskript I blev bisphenol E (BPE) testet under embryonal udvikling over 21 dage, i en reproduktionstest over 28 dage samt i embryoner fra F1-generationen udviklet fra eksponerede forældre over 20 dage. Det blev konstateret, at længde, hjertefrekvens og klækning var de første påvirkede endepunkter i embryoner ved 5151 µg/L BPE. Hos voksne individer påvirkede eksponering for BPE ikke signifikant reproduktion, vækst eller vægtøgning op til 873 µg/L, selvom der forekom en vis dødelighed ved 187 og 873 µg/L. Overvågning af F1-generationen viste en mere end 20 gange højere følsomhed i embryoner fra eksponerede forældre sammenlignet med embryoner fra ikke-eksponerede forældre. Disse resultater giver anledning til bekymring om transgenerationelle effekter af BPA-alternativer og deres potentielle indvirkning på populationsniveau, selvom direkte eksponering ikke umiddelbart synes at medføre effekter ved miljømæssigt relevante koncentrationer. I manuskript II blev toksiciteten af et andet BPA-alternativ, bisphenol AP (BPAP), vurderet i udviklende embryoner over 18 dage, og der blev udført transkriptomisk analyse for at undersøge de underliggende mekanismer. Hjertefrekvens var det mest påvirkede endepunkt ved den laveste testede koncentration. EC₅₀-værdien for embryolængde blev beregnet til 511 µg/L BPAP, hvilket var forbundet med 100% dødelighed ved 663 µg/L. Transkriptomiske data indikerede en generel stressrespons snarere end forstyrrelse af en specifik endokrin signalvej. Disse resultater viser, at L. stagnalis-embryoner er mere følsomme over for BPAP end over for BPE, hvilket fremhæver forskelle i toksicitet mellem bisphenoler. På denne baggrund blev BPAPs effekter på voksen reproduktion også undersøgt i manuskript III. En større følsomhed over for BPAP sammenlignet med BPE blev påvist, med en EC₅₀-værdi for reproduktion på 9,2 µg/L BPAP. Fødeindtagelsen blev ligeledes påvirket, ledsaget af fuldstændig væksthæmning og vægttab, hvilket førte til 50% dødelighed ved 269 µg/L. Disse observationer, kombineret med embryodata, giver anledning til bekymring vedrørende BPAP som BPA-erstatning på grund af dets højere toksicitet over for ferskvandsgastropoder. Da bisphenoler sjældent forekommer som enkeltstoffer i miljøet, blev blandingstoksiciteten af BPE og BPAP undersøgt i manuskript IV i både embryoner (18 dage) og voksne (28 dage). De samme endepunkter som ved enkeltstofeksponeringer blev påvirket, men ved lavere koncentrationer, hvilket tyder på additive effekter. Disse resultater understreger vigtigheden af at tage højde for blandingstoksicitet i miljømæssig risikovurdering. Endelig blev thyreoidealignende signalering i bløddyr undersøgt i manuskript V ved hjælp af målrettet metabolomik. T3 blev konsekvent påvist i både embryonale og post-klækkede stadier, mens andre thyreoideahormonmetabolitter kun forekom sporadisk og inkonsistent, hvilket forhindrede konklusioner om en fuldstændig thyreoideapathway. Disse resultater, sammenholdt med den eksisterende litteratur, tyder på, at snegle kan besidde endogene mekanismer til syntese og metabolisme af vertebratlignende thyreoideahormoner. På tværs af alle eksponeringsstudier afslørede HPLC–MS/MS-analyser betydelige forskelle mellem nominelle og målte koncentrationer, hvilket understreger behovet for kemisk verifikation i økotoksikologiske forsøg. Samlet set præsenterer denne afhandling de første omfattende toksicitetsdata for BPE og BPAP i L. stagnalis-embryoner og -voksne, herunder både enkelt- og blandingseksponeringer, og fremhæver transgenerationel følsomhed samt blandingseffekter. Afhandlingen bidrager endvidere til forståelsen af bløddyrs endokrine systemer for at understøtte udviklingen af adverse outcome pathways (AOPs) for hormonforstyrrende stoffer og deres integration i NAMs. Disse resultater understreger behovet for at vurdere BPA-alternativer i ferskvandshvirvelløse dyr og bidrager med væsentlig viden til forståelsen af hormonforstyrrelser hos bløddyr.