Defining the rate-limiting principles of human replisome

Koordination mellem nøje duplikation af genomet og mitotisk celledeling er afgørende for celleproliferation. Replisommaskineriet er centralt i denne proces og er grundlæggende set sårbart, da det kontinuerligt konfronteres med endo- og eksogene kilder til replikationsbarrierer. For at håndtere det fysiologiske niveau af replikationsstress, aktiveres det replisom-tilknyttede S-fasecheckpoint, hvilket undertrykker aktiviteten af CDK1/2-kinaser og koordinerer rettidig aktivering af origin-affyring. Det rejser et vigtigt grundlæggende spørgsmål: hvordan koordinerer S-fasecheckpointet global origin-aktivering? Tabet af checkpointet destabiliserer genomet ved at tvingemange replikationsgafler til at affyre samtidigt. Har S-fase checkpointet til funktion at forhindreudtømning af ratebegrænsende replisomfaktorer, som ville blive opbrugt, hvis stokastisk originaffyring skiftede til samtidig aktivering? Hvad er kilden til det fysiologiske S-fase checkpoint? I dette arbejde viste vi, at umådeholden aktivering af origins tillader samlingen af faktorer af en ledende streng, mens PCNA og PCNA-afhængige faktorer af den modsatrettede streng løber tør og ikke længere kan understøtte kooperativ modning af Okazaki-fragmenter. Vi identificerede en ny rolle for PAF15 i at indføre et dosisfølsomt kontrolpunkt for PCNA. PAF15 er en replisomfaktor, som fuldstændigt befinder sig på kromatin i S-fasen, uden nogen målbar fri pulje; denne udtømning begrænser PCNA-aktiviteten ved yderligere aktivering af origins. Interessantnok er rekrutteringen af PAF15 tæt koblet til initiering af DNA-syntese og reguleres af KEN- ogPIP-motiver. PAF15 binder PCNA med høj affinitet via PIP-motivet, passerer PCNA-DNAkanalen på den modsatrettede strenge og beskytter derved PCNA mod for tidlig dissociation afATAD5-RFC2-5-komplekset, hvilket stabiliserer PCNA på kromatin. Tab af PAF15 fører til selektiv forstyrrelse af PCNA og dets interaktion med proteiner af den modsatrettede streng, mens proteiner af den ledende streng forbliver upåvirkede. Derudover viser vi, at PCNA på den ledende streng beskyttes af fork protection-kompleksets TIMELESS og CLASPIN, hvis fjernelse fører til fejlagtig lokalisering af PAF15 ved den ledende streng. Endelig reguleres forholdet mellem PAF15og PCNA af E2F-transkriptionsnetværket; PCNA reguleres af en aktivator, E2F1, mens PAF15 er under repression af E2F4. Denne stramme kontrol af PAF15-produktion er kritisk, fordi ethvert overskud af PAF15 forstyrrer replisomets integritet. Samlet set afslører vores fund, at PAF15fungerer som en ratebegrænsende faktor i det humane replisom, som virker strengspecifikt for at kontrollere den globale DNA-replikationsdynamik i samspil med S-fase checkpointet.