Molekulare Grundlagen der Wirtsadaption des Darmpathogens Clostridioides difficile

Aufgrund der in den letzten Jahrzehnten drastisch gestiegenden Relevanz des Darmpathogens C. difficile in der Humanmedizin ist eine umfangreiche Charakterisierung des Organismus essenziell, um präventive sowie effektive therapeutische Strategien zu entwickeln. Ziel dieser Arbeit war es verschiedene Anpassungsstrategien, die der Temperatur- und Antibiotikaadaption des Organismus zu Grunde lagen, gezielt zu entschlüsseln. Darüber hinaus stand die Funktionscharakterisierung von der an der Stickland-Reaktion beteiligten Proteine im Vordergrund. Im Rahmen dessen wurde der reduktive Stoffwechselweg und dessen Interaktion mit dem membrangebundenen Rnf-Komplex fokussiert. Die molekulare und zelluläre Kälteadaption von C. difficile ist bis zum Zeitpunkt dieser Arbeit nicht untersucht worden. Im Rahmen dieses Projektes sollte die Organismus-spezifische Anpassung an Raumtemperatur (20 °C) analysiert werden. Hierfür wurde zunächst ein Kälteschockexperiment durchgeführt, bei dem die Kultivierungstemperatur schlagartig von 37 °C auf 20 °C gesenkt wurde. Weiterführende Transkriptom- und Proteomanalysen entschlüsselten eine Vielzahl molekularer Prozesse, die eine Bedeutung für die Kälteschock- und der Kälteadaptionsstrategie haben könnten. Insbesondere der Energiemetabolismus, wie auch Eisentransportsysteme und die Flagellenbiosynthese wurden durch die Temperatursenkung kontrolliert. Mittels Proteomik konnte zudem eine signifikant erhöhte Produktion von Zellwandproteinen des S-Layers im Rahmen der Kälteschockantwort detektiert werden. Vor allem das Cwp84, Cwp66 und Cwp18 schienen eine wichtige Funktion für die Schockadaption zu übernehmen. Da die Bedeutung des S-Layers und seiner Zellwandproteine im Rahmen der Organismus-spezifischen Kälteadaption bisher unbekannt ist, wurden weiterführende Analysen zur Funktionscharakterisierung angesetzt. Dazu wurde mittels ClosTron®-Technologie die Insertionsmutanten C. difficile 630∆erm-cwp18::346|347a intron ermB, C. difficile 630∆erm-cwp66::468|469a intron ermB und C. difficile 630∆erm-cwp84::358|359s intron ermB generiert, die signifikante phänotypische Wachstumsunterschiede bei Raumtemperatur (20 °C) aufwiesen. Die Kältekultivierung der Stämme resultierte zudem im Verlust des flagellaren Filaments, was zu einer Inmotitität dieser führte. Weiterführende Biofilmanalysen verdeutlichten die Bedeutung des Proteins Cwp84. Während unter Standardkultivierungsbedingungen (37 °C) die Inaktivierung von Cwp18 und Cwp66 keinen Einfluss auf die Biofilmformation hatte, zeigte die cwp84-defiziente Mutante eine signifikant erhöhte Produktion dessen. Darüber hinaus konnte eine temperaturvermittelte Regulation der Biofilmproduktion der Mutantenstämme und des parentalen Stammes nachgewiesen werden. Zudem wurde eine durch die Temperatur kontrollierte Toxinproduktion von C. difficile 630∆erm detektiert, wobei dieser unter Raumtemperatur signifikant geringer Level an TcdA und TcdB sekretierte. Die Daten dieses Projektes deuten darauf hin, dass die Organismus-spezifische Kälteadaption auf multifaktorieller Ebene betrachtet werden kann. Zudem wurden wichtige Virulenzfaktoren temperaturvermittelt reguliert. Des Weiteren scheint der S-Layer eine fundamentale Bedeutung für die Kälteschockadaption von C. difficile zu haben. Es lässt sich die Hypothese aufstellen, dass der Kälteschock eine verstärke S-Layer-Formation induzierte, um die Zelle vor dem äußeren Temperaturstress zu schützen. Weshalb die Produktion der Zellwandproteine unter adaptierten Temperaturbedingungen wiederum reguliert wurde, muss für ein umfangreiches Verständnis weiterführend analysiert werden. Die zunehmende Resistenzentwicklung von C. difficile-Stämmen gegen therapeutisch relevante Wirkstoffe bedarf es einer umfangreichen Charakterisierung, um zukünftig effektive Behandlungsansätze zu etablieren. Ziel dieses Projektes war die Identifizierung molekularer und zellulärer Prozesse, die mit der Wirkstofftoleranz korrelieren. Auf Grundlage einer erzeugten C. difficile 630∆erm-Transposonmutantenbank unter Verwendung des für das marine Transposasegen himar1 kodierende Expressionssystem pRPF215, sollten MTZ-, VAN- und FDX-resistente Mutantenstämme isoliert und weiterführend analysiert werden. Im Rahmen dessen konnte eine Mutante mit erhöhter MTZ-Toleranz isoliert werden, wohingegen keine VAN- oder FDX-resistente Stämme identifiziert wurden. Weiterführende Transposon-Insertionssequenzierungen wiesen für die isolierte Mutante eine Transposonintegration im Genlokus einer mutmaßlichen Exonuklease (CDIF630erm_01989) nach. Über weiterführende MHK-Bestimmungen und phänotypischer Wachstumsanalysen ließ sich eine MTZ-Resistenz für C. difficile 630∆erm-CDIF630erm_01989::Himar1 bestätigen. Mittels Proteomanalysen sollte die Bedeutung der mutmaßlichen Exonuklease für die Entwicklung der MTZ-Resistenz im Organismus entschlüsselt werden. Aus zeitlichen Gründen werden die Daten dieser Analyse im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht repräsentiert. Das Proteom könnte zur Aufklärung wichtiger molekularer MTZ-Adaptionsstrategien und somit zu einem detaillierteren Verständnis der Organismus-spezifische Resistenzentwicklung beitragen, die für die Entwicklung alternativer therapeutischer Ansätze zu Nutze gemacht werden können. Die Fermentation von Aminosäuren im Rahmen der Stickland-Reaktion stellt für den Organismus C. difficile eine wichtige metabolische Grundlage der Energiegewinnung dar. Ziel dieses Projektes war die Charakterisierung der bisher in ihrer Funktion unbekannten PrdD- und PrdE-Untereinheiten des für die reduktive Stickland-Reaktion essenziellen Enzyms der D-Prolin-Reduktase. Im Rahmen dessen erfolgte die ClosTron®-basierte Erzeugung der prdD- bzw. prdE-Insertionsmutante C. difficile 630∆erm-prdD::265|266s intron ermB und C. difficile 630∆erm-prdE::96|97s intron ermB. Zudem sollte die Bedeutung der Interkation der Enzymuntereinheit PrdC mit der RnfC-Untereinheit des Rnf-Komplexes anhand der rnfC/prdC-defizienten Mutante C. difficile 630∆erm-rnfC::636|637s∆prdC analysiert werden. Mittels phänotypischer Wachstumsanalysen des parentalen Stammes C. difficile 630∆erm, der über eine funktionale D-Prolin-Reduktase verfügt, konnte im Minimalmedium CDMM eine signifikante Wachstumsreduktion des WT nachgewiesen werden. Die Daten deuten somit auf ein D-Prolin entkoppeltes Wachstum der defizienten Stämme hin. Darüber hinaus konnten phänotypische Wachstumsunterschiede der prdD- und prdE-Mutanten nachgewiesen werden, was differente Funktionalitäten beider Untereinheiten impliziert. Die Hypothese lässt sich durch nachfolgende NAD+- und NADH-Quantifizierungen bestätigen, wobei die Inaktivierung von prdD zu einer erhöhten Ansammlung von NAD+ führte. Dieses Phänomen wurde auch für die rnfC- und rnfC/prdC-Mutante nachgewiesen. Des Weiteren resultierte die Inaktivierung von rnfC, prdD und prdE in der stationären Wachstumsphase in einem sichtbaren Funktionsverlust der D-Prolin-Reduktase. Für die rnfC/prdC-Mutante konnte hierbei keine Enzymaktivität nachgewiesen werden, was die Relevanz der Interaktion beider Untereinheiten für den Energiemetabolismus unterstreicht. Schlussfolgernd lässt sich anhand der Daten dieser Arbeit ableiten, dass die PrdD- und PrdE-Untereinheiten einen wichtigen Beitrag in der reduktiven Stickland-Fermentation und somit in der Energiegewinnung übernehmen. Zudem lassen sich unterschiedliche Proteinfunktionalitäten vermuten. Weiterführende Transkriptomanalysen könnten einen detaillierten Aufschluss über deren molekulare Funktion bieten.