NETosis bei Hornhautulcera

Hintergrund und Ziele Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind netzartige Strukturen, die aus extrazellulärer DNA sowie antimikrobiellen Proteinen neutrophiler Granulozyten wie Neutrophile Elastase (NE) oder Myeloperoxidase (MPO) bestehen, Mikroorganismen binden und somit bei der Pathogenabwehr eine wichtige Rolle spielen können. Nach Stimulation durch Interleukin-8 oder Lipopolysacchariden setzen Neutrophile ihre DNA sowie Granulainhalte frei, ein Vorgang, der als NETosis bezeichnet und erstmals 2004 beschrieben wurde. Der erste Nachweis von NETs an der Augenoberfläche gelang 2012 im Tränenfilm von Patient:innen mit Dry Eye Disease (DED). Dort fanden sich erhöhte Konzentrationen extrazellulärer DNA sowie NET-assoziierter Proteine wie Cathelicidin und NE. Zugleich zeigte sich eine reduzierte Aktivität von Nukleasen, die für den Abbau von NETs verantwortlich sind. Ein Ungleichgewicht zwischen NET-Bildung und -Abbau führt zur Akkumulation zelltoxischer Bestandteile wie Proteasen und proinflammatorischer Zytokine und kann somit chronische Entzündungsreaktionen aufrechterhalten. Die therapeutische Applikation von DNase I, einer extrazellulären Endonuklease, führte bei DED-Patient:innen zu einer Verringerung der Symptomatik und Menge an extrazellulärer DNA. Auch bei Graft-versus-Host-Disease konnten erhöhte Spiegel von NE, MPO, MMP-8 und MMP-9 im Tränenfilm nachgewiesen werden, die zu Kollateralschäden am Gewebe führen können. Bisher gibt es keine Untersuchungen, ob degranulierende und NET-bildende Neutrophile bei humanen Hornhautulcera unterschiedlicher Ätiologien an der Bekämpfung von Keimen an der Hornhaut beteiligt sein könnten. Ziel dieser Arbeit war daher der Nachweis extrazellulärer DNA sowie der NET-Marker NE und MPO in humanen Hornhautulcera mittels Immunfluoreszenz. Ferner sollten die Präparate auf das Vorhandensein von kondensierten beziehungsweise multilobulierten (viablen), degranulierenden sowie NET-bildenden Neutrophilen untersucht, die neutrophile Infiltration und Aktivität in Präparaten der mikrobiellen Keratitis mit den anderen untersuchten okulären Pathologien verglichen und der Anteil der Aggregate, normalen (intakten) Nuklei und nukleären Fragmente (extrazellulärer DNA) an der gesamten neutrophilen Infiltration in einem Präparat sowie ihre jeweilige Fluoreszenzintensität bestimmt werden. Methoden Im Rahmen von Keratoplastiken an der Augenklinik des Universitätsklinikums Mainz wurden insgesamt 22 humane Hornhautpräparate gewonnen, welche sowohl von Patient:innen mit mikrobieller Keratitis als auch mit anderen entzündlichen und nicht-entzündlichen Pathologien wie Keratokonus oder traumatischen Hornhautverletzungen stammten. Die Präparate wurden formalin-fixiert, in Paraffin eingebettet und bei klinischem Verdacht auf infektiöse Ätiologien mikrobiologisch untersucht. Mittels Immunfluoreszenz wurden DNA (DAPI), NE und MPO detektiert. NE- und MPO-positive Bereiche wurden dann nach ihrem Erscheinungsbild bewertet und auf multilobulierte (viable), degranulierende und NET-bildende Neutrophile sowie NETs untersucht (siehe Tabelle 11 und Tabelle 12). Mithilfe digitaler Bildanalyse wurden das Ausmaß der neutrophilen Infiltration, die Kolokalisation von NE / MPO mit DNA sowie zytomorphometrische Merkmale ausgewertet. Letztere wurden für t-SNE-Analysen herangezogen, um visuelle Muster zwischen den unterschiedlichen Pathologien zu identifizieren. Darüber hinaus wurden der Anteil der Aggregate, normalen Nuklei und DNA-Fragmente quantifiziert und ihre jeweilige Fluoreszenzintensität bestimmt. Ergebnisse und Beobachtungen In Proben mit inflammatorischer Pathogenese, insbesondere denen der mikrobiellen Keratitis, erschien die NE / MPO oft diffus verteilt und war in unterschiedlichem Ausmaß mit extrazellulärem Chromatin / DNA verknüpft. Degranulierende und NET-bildende Neutrophile konnten identifiziert werden. Proben mit geringer Entzündungsaktivität zeigten eher Neutrophile mit einem multilobulierten Zellkern sowie einige frühe Stadien NET-bildender Neutrophiler. Keratokonus-Proben wiesen erwartungsgemäß keine neutrophile Infiltration auf. Präparate der mikrobiellen Keratitis zeigten eine signifikant höhere neutrophile Infiltration und Aktivität (Kolokalisation) im Vergleich zu anderen Pathologien. Die zytomorphometrischen Analysen und t-SNE-Plots illustrierten klar unterscheidbare Muster zwischen stark (häufig Proben der mikrobiellen Keratitis) und gering infiltrierten Proben (häufig andere okuläre Pathologien). Erstere wiesen mehr nukleäre Fragmente auf, was auf verstärkt ablaufende lytische Prozesse aufgrund gesteigerter Entzündungsreaktionen hindeutet. Die Fluoreszenzintensität extrazellulärer DNA war signifikant geringer als die von intakten Zellkernen und Aggregaten. Die quantitative Bestimmung des Anteils der Subtypen (Aggregate, normale Nuklei, nukleäre Fragmente) und ihrer Fluoreszenzintensitäten konnte in mehreren Präparaten erfolgreich umgesetzt werden. Schlussfolgerungen und Diskussion Meine Untersuchungen zeigen erstmals, dass NETs, NET-bildende und degranulierende Neutrophile in humanen Hornhäuten verschiedener inflammatorischer okulärer Pathologien nachweisbar sind und daher möglicherweise eine Rolle in der Pathogenese dieser Erkrankungen spielen. Bei Proben der mikrobiellen Keratitis zeigte sich eine signifikant höhere NE / MPO-Infiltration sowie Kolokalisation im Vergleich zu den übrigen okulären Pathologien, was auf eine stärkere Entzündungsreaktion (Degranulation und NET-Bildung) und Aktivierung von Neutrophilen in der Gruppe der mikrobiellen Keratitis hinweist. Die Präsenz unterschiedlicher neutrophiler Stadien reflektiert die jeweiligen Entzündungsphasen. Während gering entzündete Proben überwiegend viable Neutrophile und frühe NETosis-Stadien aufwiesen, zeigten stark entzündete Präparate NET-bildende Neutrophile, die ihre typischen morphologischen Veränderungen im Früh- und Spätstadium der NETosis durchlaufen. Diese wurden gehäuft in oberflächennahen Arealen gefunden, was auf eine Beteiligung der NETs an der Abwehr eindringender Pathogene sowie auf eine Migration Neutrophiler über limbale Gefäße hindeutet. Zytomorphometrisch konnte gezeigt werden, dass stark infiltrierte Präparate, insbesondere bei mikrobieller Keratitis, deutlich mehr nukleäre Fragmente aufwiesen, was auf die verstärkten lytischen Prozesse im Rahmen einer gesteigerten Entzündungsreaktion hinweist. NETs bilden eine wichtige Säule der antimikrobiellen Abwehr, können bei überschießender Bildung jedoch Gewebeschäden, gestörte Wundheilung und Hyperinflammation verursachen. Ob der protektive oder schädigende Effekt bei entzündlichen Erkrankungen der okulären Oberfläche überwiegt, bleibt Gegenstand zukünftiger Untersuchungen. Die erfolgreiche Quantifizierung des Anteils von Aggregaten, normalen Nuklei und nukleären Fragmenten (extrazellulärer DNA) an der gesamten neutrophilen Infiltration sowie der Fluoreszenzintensität ebendieser bietet eine Grundlage für Vergleiche dieser Parameter in zukünftigen Forschungsarbeiten.