Λειτουργικές αλληλεπιδράσεις της χρωματίνης με τα σηματοδοτικά μονοπάτια ανάπτυξης στα φυτά

Η HEAT SHOCK PROTEIN 90 (HSP90) οικογένεια πρωτεϊνών με δράση μοριακού συνοδού, αποτελεί συστατικό στοιχείο του συστήματος της πρωτεόστασης και είναι εξαιρετικά συντηρημένη μεταξύ φυλογενετικά απομακρυσμένων οργανισμών. Έχει δειχθεί ότι οι HSP90 διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής ομοιόστασης, εμπλέκονται σε πλήθος αναπτυξιακών μονοπατιών καθώς και στην εξελικτική διαδικασία. Χαρακτηρίζονται από επιλεκτικότητα ως προς τα υποστρώματά τους, τα οποία διατηρούν σε λειτουργική διαμόρφωση σε συνεργασία με μια πληθώρα βοηθητικών πρωτεΐνών που ονομάζονται συν-τσαπερόνες. Ενώ η δράση τους εξασκείται κυρίως στο κυτταρόπλασμα, στα μετάζωα έχει αρχίσει να αναδεικνύεται ο ρόλος τους στον πυρήνα και ειδικότερα στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης τόσο μέσω του ελέγχου της μεταγραφικής μηχανής όσο και μέσω της ρύθμισης της δομής της χρωματίνης. Στο φυτό Arabidopsis thaliana, η HSP90 οικογένεια αποτελείται από επτά μέλη εκ των οποίων τα τέσσερα είναι κυτταροπλασματικά, ενώ τα υπόλοιπα έχουν οργανιδιακή τοποθέτηση. Μέχρι στιγμής, οι κυριότεροι μηχανισμοί που έχουν περιγραφεί για τις HSP90 στο Arabidopsis αφορούν στον έλεγχο της λειτουργικότητας ή σταθερότητας κομβικών πρωτεϊνών σε μονοπάτια μεταγωγής σήματος, όπως υποδοχείς, κινάσες ή μεταγραφικοί παράγοντες. Η συμμετοχή τους στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος των μπρασσινοστεροειδών (BR) και του γιασμονικού οξέως (JA) είναι θεμελιωμένη, ενώ πλέον έχει αρχίσει να αναδεικνύεται ο κεντρικός ρόλος τους στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος της αυξίνης. Αντιθέτως, δεν έχει διερευνηθεί η συμμετοχή των HSP90 στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος των γιββερελλινών (GA), που συνεργάζεται με το μονοπάτι των BR. Οι GA είναι φυτικές ορμόνες που προάγουν την αλλαγή από τη βλαστική στην αναπαραγωγική φάση ανάπτυξης και αποτελούν αρνητικό ρυθμιστή της δημιουργίας του άνθους. Μέσω ενός συνδυασμού μεθοδολογιών γενετικής ανάλυσης, βιοχημείας, μοριακής βιολογίας και μικροσκοπίας ταυτοποιήθηκε η φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ των HSP90.1 και ΗSP90.3 με δύο μέλη των DELLA πρωτεϊνών (RGA και GAI), που αποτελούν κεντρικούς αναστολείς του μονοπατιού των GA. Η ανάλυσή έδειξε ότι έλλειψη λειτουργίας του HSP90 μοριακού συνοδού (είτε φαρμακολογική είτε γενετική) οδηγεί σε απορρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων βιοσύνθεσης και καταβολισμού των GA καθώς και σε σταθεροποίηση των DELLA σε κύτταρα με μεγάλο δυναμικό επιμήκυνσης. Τα δεδομένα που προέκυψαν συνηγορούν υπέρ της εμπλοκής των HSP90 στο ορμονικό μονοπάτι μεταγωγής σήματος των GA καθώς και της λειτουργίας τους ως μόρια ενσωμάτωσης σημάτων που προέρχονται από ενδογενή προγράμματα ανάπτυξης. Μετά τη φύτρωση, η υπέργεια ανάπτυξη του φυτού οφείλεται σε έναν θώκο μεριστωματικών κυττάρων στην κορυφή του βλαστού, που είναι γνωστός ως ακραίο μερίστωμα του βλαστού (ΑΜΒ), περιοχή στην οποία ενσωματώνονται τα σινιάλα μετάβασης στην άνθιση. Η άνθιση είναι η πιο σημαντική μετάβαση στον κύκλο ζωής των φυτών και για κάποια είδη όπως το Arabidopsis είναι μη αντιστρεπτή. Ως απόκριση στα επαγωγικά σινιάλα, το ΑΜΒ αυξάνει σε μέγεθος και μεταβάλει το σχήμα του, με τελικό αποτέλεσμα την μεταβολή της ταυτότητας των πλάγιων οργάνων από φύλλα σε άνθη. Φυτικές σειρές με μειωμένα επίπεδα των κυτταροπλασματικών HSP90 χαρακτηρίζονται από ανωμαλίες στην αρχιτεκτονική του βλαστού και στην υπέργεια ανάπτυξή τους όπως και στη μετάβαση στην άνθιση. Γι’ αυτόν τον λόγο, στα πλαίσια της παρούσας διατριβής διερευνήθηκε περαιτέρω η εμπλοκή των HSP90 στον έλεγχο της ομοιόστασης του μεριστώματος και στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης για το συντονισμό της ανάπτυξης με το περιβάλλον. Μελετήθηκε διεξοδικά ο χρόνος άνθισης σε διαφορετικές φωτοπεριόδους, και η αρχιτεκτονική του ΑΜΒ σε κυτταρικό επίπεδο διαγονιδιακών σειρών με χαμηλά επίπεδα HSP90 (hsp90 T-DNA μεταλλάγματα και αποσιωπημένες HSP90RNAi σειρές), καθώς επίσης και στα διπλά μεταλλάγματα hsp90/wus και hsp90/clv3, επιβεβαιώνοντας την εμπλοκή των HSP90 στη ρύθμιση της ομοιόστασης του ΑΜΒ και στην απόκρισή του σε ενδογενή και περιβαλλοντικά σινιάλα. Με τη χρήση μοριακών και μικροσκοπικών τεχνικών και κατάλληλων διαγονιδιακών σειρών δείχθηκε ότι οι HSP90 επηρεάζουν τη χωρική έκφραση του γονιδίου CLV3 και ρυθμίζουν θετικά την έκφραση του WUS στη βλαστική φάση ανάπτυξης. Επιπλέον, δείχθηκε ότι η μείωση των HSP90 επιπέδων διαταράσσει την απόκριση των κυττάρων του ΑΜΒ στην ορμόνη αυξίνη, αναλύοντας την έκφραση του βιοδείκτη DR5, και μελετώντας την τοποθέτηση του PIN1 μεταφορέα της αυξίνης. Επίσης, στην έλλειψη των HSP90 απορρυθμίζεται η συντονισμένη μεταβολή του μεγέθους και σχήματος του μεταβατικού ΑΜΒ. Τέλος, η συμμετοχή των HSP90 στη μετάβαση στην άνθιση γίνεται τόσο στο φύλλο όσο και στο ΑΜΒ. Στην έλλειψή των HSP90, επηρεάζεται ο συντονισμός της έκφρασης των κεντρικών γονιδίων ενσωμάτωσης των σινιάλων της άνθισης και η επαγωγή των γονιδίων εγκαθίδρυσης της ανθικής ταυτότητας. Η διερεύνηση της αλληλεπίδρασης των HSP90 με επιγενετικούς ρυθμιστές όπως τα REF6 και μέλη του PRC2 συμπλόκου, καθώς και η εξέταση της παρουσίας των HSP90 στο Arabidopsis σε γονιδιωματική κλίμακα, προσφέρει ενδείξεις για το σημαντικό ρόλο τους στη ρύθμιση της μετάβασης στην άνθιση και στην εγκαθίδρυση του ανθικού μεριστώματος μέσω της επιγενετικής ρύθμισης των γονιδίων που ρυθμίζουν αυτές τις διαδικασίες. Συνοπτικά, στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε ο ρόλος των HSP90 στη μετάβαση στην άνθιση και στην εγκαθίδρυση του ανθικού μεριστώματος, καθώς και η συμμετοχή τους στον ορμονικό έλεγχο αυτών των διαδικασιών. Επιπρόσθετα, διερευνήθηκε η εμπλοκή των HSP90 στον έλεγχο της ομοιόστασης του μεριστώματος και στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης για το συντονισμό της ανάπτυξης με το περιβάλλον.