Detección del agente causante de la “mancha” en cereza (Botrytis sp.) mediante PCR

En los últimos años se está detectando con mayor frecuencia una enfermedad conocida como “mancha” en las cerezas producidas en la región extremeña del Valle del Jerte, la cual comienza con la infección de la cereza por las especies Botrytis cinerea y Botrytis euroamericana. Debido a esto, el objetivo de este trabajo fue desarrollar un método de PCR para la detección del agente causante de la “mancha” en cereza (Botrytis sp.). Para la realización de este trabajo se utilizaron 4 cepas pertenecientes a especies asociadas a la “mancha”, B. cinerea CECT2850 y CECT20793, y B. euroamericana M43 y M2BC. Para la realización de las reacciones de PCR se utilizaron 8 parejas de cebadores diseñados a partir de los genes HSP60, RPB2 y G3PDH de B. cinerea y B. euroamericana. Con aquellas parejas con las que se obtuvieron mejores resultados se evaluó un gradiente de temperaturas de hibridación que osciló entre 50 y 56ºC. Finalmente, se estudió la sensibilidad del método mediante la extracción de ADN de cerezas inoculadas con distintas concentraciones de esporas de ambas especies. Las parejas de cebadores HSP60-F1D/R1D y RPB2-F1D/R1D permitieron la amplificación de manera específica de B. euroamericana. Por otro lado, la pareja de cebadores G3PDH-F2D/R2D, permitió la amplificación específica de B. cinerea, mientras que la pareja de cebadores G3PDH-F3I/R3I amplificó de manera específica las 4 cepas estudiadas. Las condiciones de PCR fueron: 35 ciclos desnaturalización (94ºC), hibridación (56ºC) y extensión (72ºC). La sensibilidad del método se estableció en 102 esporas/cereza. Los métodos desarrollados demostraron ser rápidos y específicos para la detección tanto in vitro como in vivo de estas especies en cereza.