Технология ПЦР-анализа в режиме реального времени для выявления мутации основателя в гене NBS1 как причины формирования синдрома Ниймеген

Введение. Синдром Ниймеген – аутосомно-рецессивное заболевание, относящееся к врожденным нарушениям иммунитета, характеризующееся микроцефалией, иммунодефицитом, нарушением репарации ДНК, что приводит к высокой чувствительности к ионизирующему излучению и повышенному риску злокачественных новообразований. Постановка диагноза синдрома Ниймеген проводится на основе сочетания клинических признаков, результатов иммунологических и молекулярно-генетических методов исследования, включая определение количества копий эксцизионных колец ДНК TREC/KREC, а также метода секвенирования по Сэнгеру. Однако метод секвенирования характеризуется высокой стоимостью проведения исследования, что влечет за собой необходимость в разработке альтернативного метода диагностики на основе ПЦР. Цель. Разработать технологию ПЦР в режиме реального времени для выявления гомозиготных и гетерозиготных мутаций основателя в гене NBS1 для повышения уровня диагностики синдрома Ниймеген. Материалы и методы. В исследование были включены пациенты с гомозиготной мутацией в гене NBS1 (N=8), гетерозиготные носители (N=6), здоровые лица (N=10). Разработка ПЦР-технологии для определения наличия альтернативного варианта c.657_661del5 проводилась с использованием реагентов для ПЦР «ArtMix Color ДНК-полимераза» (АртБиоТех, Беларусь) на термоциклере CFX96 (Bio-Rad, США). Наличие альтернативного варианта в 6-м экзоне гена NBS1 дополнительно подтверждалось капиллярным секвенированием по Сэнгеру на генетическом анализаторе ABI 3130, Hitachi (Япония). Полученные в ходе секвенирования данные анализировались при помощи специализированного программного обеспечения Sequencing Analysis 5.2 и BioEdit. Результаты. В 2025 году в РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии технология выявления гомозиготной и гетерозиготной мутации в 6-м экзоне гена NBS1 с использованием ПЦР в режиме реального времени с анализом кривых плавления была проведена у 8 пациентов с гомозиготной мутацией, у 6 гетерозиготных носителей и у 10 здоровых детей. Гомо- и гетерозиготные образцы идентифицируются по различиям в форме кривой плавления. В ситуации, когда в целевой последовательности присутствует гомозиготная делеция, детектируемая как один результирующий пик плавления продукта ПЦР слева при температуре 73,2 °С, при отсутствии генетического нарушения будет детектироваться один пик справа при 76,2 °С, при наличии гетерозиготной делеции – два пика: первый (мутантный) слева при температуре 73,2 °С, второй (дикий тип) справа при температуре 76,2 °С. Заключение. Разработана технология ПЦР в режиме реального времени для выявления гомо- и гетерозиготных мутаций основателя в гене NBS1 для улучшения качества диагностики синдрома Ниймеген. Разработанная методика позволяет определить как гомозиготную делецию в гене NBS1 657del5, которая ассоциирована с синдромом Ниймеген, так и гетерозиготное носительство у родственников пациентов с целью определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям. Introduction. Nijmegen syndrome is an autosomal recessive disorder classified as a congenital immune disorder (CI) characterized by microcephaly, immunodeficiency, and DNA repair deficiency, which lead to high sensitivity to ionizing radiation and an increased risk of malignant neoplasms. The diagnosis of Nijmegen syndrome is based on a combination of clinical signs, results of immunological and molecular genetic research methods, including determination of the number of TREC/KREC excision rings, as well as the Sanger sequencing method. However, this research method is characterized by a high cost of research, thus requiring an alternative PCR-based diagnostic method to be elaborated. Purpose. To elaborate a real-time PCR technique for detecting homozygous and heterozygous founder mutations in the NBS1 gene to improve the diagnosis of Nijmegen syndrome. Materials and methods. The study included 8 patients with homozygous mutation in the NBS1 gene, 6 heterozygous carriers, and 10 healthy individuals. PCR technique for detecting the presence of the alternative variant c.657_661del5 was elaborated using ArtMix Color DNA polymerase PCR reagents (ArtBioTech, Belarus) on a CFX96 thermal cycler (Bio-Rad, USA). The presence of an alternative variant in exon 6 of the NBS1 gene was further confirmed by capillary Sanger sequencing using an ABI 3130 genetic analyzer, Hitachi (Japan). The data obtained during sequencing were analyzed using specialized software "Sequencing Analysis 5.2" and "BioEdit". Results. In 2025, at the Center for Pediatric Oncology, Hematology and Immunology, the technique for detecting homozygous and heterozygous mutations in exon 6 of the NBS1 gene using real-time PCR with analysis of melting curves was performed in 8 patients with homozygous mutation, 6 heterozygous carriers, and 10 healthy children. Homozygous and heterozygous samples are identified by differences in the shape of the melting curve. When a homozygous deletion is present in the target sequence, it is detected as one resulting melting peak of the PCR product on the left at the temperature of 73.2 °C; in the absence of a genetic disorder, one peak on the right at 76.2 °C will be detected; in the presence of a heterozygous deletion, two peaks are detected: the first (mutant) one on the left at a temperature of 73.2 °C, and the second (wild type) one on the right at the temperature of 76.2 °C. Conclusion. We elaborated a real-time PCR technique to detect homozygous and heterozygous founder mutations in the NBS1 gene to improve the quality of Nijmegen syndrome diagnostics. The methodology elaborated allows determining both homozygous deletion in the NBS1 657del5 gene, which is associated with Nijmegen syndrome, and heterozygous carriage in patients’ relatives in order to determine the predisposition to oncological diseases.