Identifizierung und Charakterisierung von disseminierten Krebszellen im Knochenmark von Brustkrebspatientinnen mittels EpCAM, CD27/CD319 Immunfluoreszenzfärbung

Hintergrund: Metastasengründende disseminierte Tumorzellen (DCCs) stellen ein wichtiges Ziel in der Tumorforschung dar. Obwohl ihre Präsenz im Körper mit einer schlechteren Prognose und einer erhöhten Rückfallwahrscheinlichkeit assoziiert ist, gibt es bisher keine spezifischen therapeutischen Konzepte zu ihrer Behandlung. Ein Hauptproblem bei der Entwicklung solcher Behandlungsansätze ist die zuverlässige Erkennung dieser DCCs. Es ist bekannt, dass das epitheliale Zelladhäsionsmolekül (EpCAM), das häufig als Marker zur Identifizierung von DCCs genutzt wird, auch einige nicht-kanzeröse Zellen (NCCs) im Knochenmark detektiert. Um dieses Problem anzugehen, hat unsere Forschungsgruppe diese Zellen genau charakterisiert. Basierend auf früheren RNA-Sequenzierungsdaten wurden die Immunmarker CD27 und CD319 (=SLAMF7) ausgewählt, um EpCAM+ DCCs von EpCAM+ NCCs zu unterscheiden. Durchflusszytometrie wurde verwendet, um Zellen basierend auf ihrer EpCAM- und CD45-Expression in DCCs und NCCs zu klassifizieren. Es wurde festgestellt, dass Zellen mit EpCAM hoch/CD45+ (vermutlich NCCs) signifikant häufiger die Immunmarker CD27 und CD319 exprimieren als Zellen mit EpCAM hoch/CD45- (vermutlich DCCs). Methoden: In der vorliegenden Arbeit wurde die Immunfluoreszenzfärbung mit EpCAM und CD27/CD319 an Knochenmarksproben von 33 M0-Patienten sowie an sechs Proben von gesunden Spendern angewendet. Die Marker CD27 und CD319 wurden mit demselben Fluorochrom markiert und in demselben Mikroskopkanal analysiert. Die beiden Marker wurden auch in den nachfolgenden Analysen zusammengefasst. Insgesamt wurden 37 EpCAM+/CD27, 319- Zellen (potenzielle DCCs) und 50 EpCAM+/CD27, 319+ Zellen (potenzielle NCCs) aus den M0-Patienten isoliert. Zusätzlich wurden fünf EpCAM+/CD27, 319+ Zellen aus gesunden Spendern sowie EpCAM-/CD27, 319+ Zellen (potenzielle Immunzellen) aus jeder Probe isoliert, um als Kontrollzellen in der Studie zu dienen. Anschließend wurde die Genexpressionsprofilierung mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) an den Markertranskripten EpCAM, CD27, CD319 sowie an zuvor identifizierten DCC-spezifischen (AHSP und CA1) und NCC-spezifischen (AHNAK und JUN) Transkripten durchgeführt. Mit Hilfe der in der qPCR verwendeten Gene wurden die Zellen in DCCs, NCCs und nicht eindeutig klassifizierbare Zellen (als undefiniert beschrieben) eingeteilt. Die anschließende Analyse von Kopienzahlveränderungen (CNA) mittels Low-Pass-Sequenzierung sollte die Eignung von CD27 und CD319 zur Unterscheidung von DCCs und NCCs testen. Nur Proben mit σ∆* < 0,2 wurden qualitativ als geeignet angesehen und in die weiteren Analysen einbezogen. Die bioinformatische Auswertung basierte darauf, das Genom in Abschnitte von 500 Kilobasen (kb) zu unterteilen. Eine Abweichung musste mindestens 25 Abschnitte umfassen, damit die Probe als aberrant und damit als potenzieller DCC angesehen wurde. Ergebnisse: Mithilfe der qPCR wurde festgestellt, dass EpCAM+/CD27, 319- Zellen signifikant häufiger DCC-spezifische Signaturgene exprimierten als EpCAM+/CD27, 319+ Zellen (p=0,002). Letztere ähnelten auf Transkriptebene stärker den EpCAM- Immunzellen der Kontrollgruppe und exprimierten NCC-spezifische Signaturgene (p=1). Nach strengen Qualitätskontrollen konnten nur ein Fünftel der ursprünglich isolierten Zellen in die CNA-Analyse einbezogen werden. Zellen mit einem EpCAM+ Phänotyp wiesen in 100 % der Fälle ein balanciertes Genom auf. Auch Zellen mit einer DCC- oder NCC-spezifischen Signatur zeigten konsistent ein balanciertes Genom. Unerwarteterweise zeigten die EpCAM- Immunzellen in 18,2 % der Fälle ein aberrantes Genom. Interessanterweise konnten die aberranten Zellen nur einer undefinierten Signatur in der qPCR zugeordnet werden. Betrachtet man die qPCR-Ergebnisse, so ist ebenfalls bemerkenswert, dass 39,0 % der EpCAM- Immunzellen undefiniert blieben. Für die Immunfluoreszenzfärbung mit EpCAM und CD27/319 wurde eine Spezifität von 74,3 % und ein negativer Vorhersagewert von 92,8 % berechnet. Fazit: Die Immunfluoreszenzfärbung mit EpCAM und CD27/CD319 eignet sich daher gut, um unerwünschte NCCs auszuschließen, jedoch nicht für die spezifische Identifizierung von DCCs. Die Tatsache, dass nur EpCAM- Immunzellen oder Zellen mit einer undefinierten Signatur in der qPCR ein aberrantes Genom zeigten, deutet darauf hin, dass die Detektion von DCCs auf der Grundlage von EpCAM allein nicht ausreichend ist, da eine große Population von Krebszellen unentdeckt bleibt. Um EpCAM+ DCCs spezifischer zu detektieren, sollte ein zusätzliches Markerprotein für die Fluoreszenzmikroskopie etabliert werden.