Untersuchungen zu den Auswirkungen eines Bestrophin-1-Knockouts sowie einer Wirkstoffbehandlung in hiPSC-RPE Zellen

Das Bestrophin-1 (BEST1) Protein wird vom BEST1 Gen kodiert und ist ein integrales Membranprotein, welches beim Menschen vorwiegend in der basolateralen Plasmamembran des retinalen Pigmentepithels (RPE) zu finden ist. Es wird als Kalzium-regulierter Chlorid-Kanal beschrieben, der aus fünf identischen BEST1-Untereinheiten zusammengesetzt ist. Neben Chlorid transportiert dieser Kanal weitere monovalente Ionen und spielt vermutlich eine Rolle im volumenregulierten Anionen-Strom. Mutationen im BEST1 Gen können zu unterschiedlichen Phänotypen von Netzhaut-Erkrankungen führen, welche als Bestrophinopathien bezeichnet werden. Dazu zählen der Morbus Best (M. Best), die autosomal dominante Vitreoretinochoroidopathie (ADVIRC) sowie die autosomal rezessive Bestrophinopathie (ARB). Ebenfalls mit Mutationen im BEST1 Gen in Verbindung gebracht wurden das autosomal dominante Mikrokornea- Zapfen-Stäbchen-Dystrophie- Katarakt- posteriores Staphylom-Syndrom (MRCS-Syndrom) sowie die autosomal dominante Retinitis Pigmentosa (RP). Klinisch präsentieren sich die Bestrophinopathien durch progressiven zentralen Visusverlust, einen reduzierten light peak im Elektrookulogramm sowie die zunehmende Akkumulation von Lipofuszin, welche in der Fundoskopie zu erkennen ist. Eine zugelassene Therapie gibt es bis heute nicht. Ziel dieser Arbeit war es, mithilfe eines BEST1-Knockouts (BEST1-KO) in differenzierten RPE-Zellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) einen Beitrag zur Grundlagenforschung zu leisten sowie die potentielle therapeutische Wirksamkeit von Curcumin (CC) und Curcumin Light (CCL) bei den Bestrophinopathien zu untersuchen. Zusätzlich wurden hiPSC-RPE Zelllinien mit einem Knockout des leucine-rich repeat-containing protein 8A (LRRC8A-KO) in die Untersuchung einbezogen, um beobachtete Effekte spezifisch dem Verlust von BEST1 oder generellen Volumenregulationsmechanismen zuordnen zu können. Bei der Analyse der Autofluoreszenz sowie der Akkumulation von Photorezeptor-Außensegmenten (POS) nach vier- bis achtwöchiger Zugabe von POS konnte kein klarer Trend nach Zelllinie, Dauer oder Konzentration der POS-Zugabe gezeigt werden. Eine eindeutige Aussage war aufgrund komplexer Analysebedingungen nicht zu treffen. Im selben Versuchsansatz wurden mittels qRT-PCR Marker für Drusenbildung, Seneszenz und Stress in den behandelten hiPSC-RPE Zellen untersucht. Auch hierbei konnte kein klarer Trend gezeigt werden. In einem weiteren Experiment wurden Kontroll-, BEST1-KO und LRRC8A-KO hiPSC-RPE Zelllinien über 7 und 24 h mit POS inkubiert und der Rhodopsin-Abbau analysiert. Hierbei konnte die in M. Best hiPSC-RPE beschriebene Einschränkung beim Rhodopsin-Abbau im BEST1-KO nicht bestätigt werden. Auch bei Vorliegen eines LRRC8A-KO wurde kein eindeutiger Effekt deutlich. Darüber hinaus wurde in Kontroll-, BEST1-KO, LRRC8A-KO, M. Best und ARB hiPSC-RPE Zellreihen der lysosomale pH (pHLys) nach zweiwöchiger POS-Zugabe analysiert. Die in der Literatur beschriebene verminderte lysosomale Azidifizierung in M. Best hiPSC-RPE Zellen nach POS-Zugabe konnte nicht reproduziert werden. In keiner der verwendeten Zellreihen konnte eine Erniedrigung des pHLys nach POS-Zugabe beobachtet werden. Sowohl unter Basalbedingungen als auch mit POS-Zugabe zeigten die M. Best und ARB Zelllinien zudem tendenziell eher niedrigere pHLys-Werte als die Kontrollzellen. Im Gegensatz dazu zeigten die BEST1-KO und LRRC8A-KO Zellen keine signifikanten Unterschiede zur Kontrolle. Die Zellreihen der einzelnen Subgruppen unterschieden sich zum Teil signifikant voneinander, was eine eindeutige Interpretation erschwerte. Für CC wird neben antioxidativen, antikanzerogenen, antiinflammatorischen sowie neuroprotektiven Eigenschaften auch eine potentielle Rolle in der Behandlung von retinalen Erkrankungen untersucht. In dieser Arbeit wurde zusätzlich CCL verwendet, ein Wirkstoff der bei unverändertem Wirkmechanismus eine erhöhte Stabilität aufweist. In einer M. Best und einer ARB Zelllinie zeigte sich eine höhere BEST1 mRNA-Expression nach der Behandlung mit CCL, jedoch ohne statistische Signifikanz und ohne nachweisbaren Effekt auf Proteinebene. Die jeweils zweite M. Best und ARB Zelllinie zeigte keinerlei Reaktion auf die CCL-Zugabe. Eine mögliche Wirksamkeit von CCL scheint daher nur bei bestimmten Mutationen vorzuliegen, insgesamt bleibt der therapeutische Nutzen von CCL in der Behandlung von Bestrophinopathien daher fraglich.