Prä- und Posthomogenisierungsfärbung mit Antikörpern und Nanokörpern bei X10heat-Expansionsmikroskopie

Hintergrund: Konventionelle Lichtmikroskopie ist durch die Beugungsgrenze des Lichts limitiert und kann Strukturen kleiner als ~200 nm nicht auflösen. Super-Resolution-Mikroskopie (SRM)-Techniken wie STED, STORM, PALM und SIM überwinden diese Grenze, erfordern jedoch kostenintensives Equipment und spezielles Fachwissen. Die 2015 eingeführte Expansionsmikroskopie (ExM) bietet einen alternativen Ansatz, indem biologische Proben in quellbare Hydrogele eingebettet und physikalisch vergrößert werden, sodass hochauflösende Bildgebung mit konventionellen Mikroskopen möglich wird. Klassische ExM-Protokolle basieren auf proteolytischer Homogenisierung mit Proteinase K, was jedoch zu Fluorophorverlust und Signalabschwächung führt. Methoden: Zur Lösung dieses Problems wurde das X10heat-Protokoll (X10ht) entwickelt, das eine hitzeinduzierte Homogenisierung bei 100 °C in einem alkalischen, detergenzienreichen Puffer nutzt. In dieser Arbeit wurden verschiedene Antikörper- und Nanokörper-Kombinationen hinsichtlich ihrer Kompatibilität mit der X10ht-Expansionsmikroskopie an Neuronen und HEK-Zellen untersucht. Dabei wurden sowohl Prähomogenisierungs- als auch Posthomogenisierungsfärbungen getestet. Ergebnisse: Prähomogenisierungsfärbungen lieferten robuste Fluoreszenzsignale über verschiedene Antikörperkombinationen hinweg. Posthomogenisierungsfärbungen, die den Vorteil haben könnten, Fluorophorverlust zu vermeiden, führten zu heterogenen Ergebnissen und hingen stark von der Hitzestabilität der Antikörper sowie der Epitopeerkennung ab. Nanokörper bieten prinzipiell Vorteile durch geringere Verknüpfungsfehler und höhere Lokalisierungsgenauigkeit, zeigten jedoch in dieser Studie schwache Fluoreszenzsignale, vermutlich aufgrund einer geringeren Anzahl gekoppelter Fluorophore. Schlussfolgerung: Die X10ht-Expansionsmikroskopie zeigt großes Potenzial für die hochauflösende Proteinbildgebung mit konventionellen Mikroskopen. Die Ergebnisse verdeutlichen sowohl die Stärken als auch die aktuellen Einschränkungen bei der Anwendung von Antikörpern und Nanokörpern im X10ht-Protokoll. Zukünftige Arbeiten sollten optimierte Färbestrategien, einschließlich Postexpansionsfärbungen, sowie die Kombination mit etablierten SRM-Techniken wie ExSTED, ExSTORM und ExPALM untersuchen, um die Bildauflösung und Signalqualität weiter zu verbessern.