Diagnostische Leistungsfähigkeit nichtinvasiver Pränataltests zur Bestimmung fetaler Merkmale des Rh-Blutgruppensystems

Seit etwa 25 Jahren besteht die Möglichkeit, zellfreie fetale DNA aus mütterlichem Blut nichtinvasiv auf genetisch determinierte Merkmale zu untersuchen. Damit werden invasive Verfahren wie Amniozentese und Chorionzottenbiopsie, die mit einem niedrigen Abortrisiko verbunden sind, in bestimmten Bereichen ergänzt, etwa bei der pränatalen Erkennung von Aneuploidien und fetalen genetischen Rh-Blutgruppenmerkmalen. Dies ist besonders relevant bei der Risikoevaluierung von Schwangerschaften, in denen die Mutter gegen ein Antigen des Rh-Blutgruppensystems immunisiert ist, da bei einem Fetus mit dem entsprechenden Antigen das Risiko für einen Morbus haemolyticus neonatorum besteht. Die Einführung der pränatalen und postnatalen Anti-D-Prophylaxe führte zu einem deutlichen Rückgang der Anti-D-Sensibilisierungsrate. In Unkenntnis des pränatalen fetalen RhD-Status erhielt jedoch jede RhD-negative Schwangere eine ungezielte Anti-D-Prophylaxe, obgleich der Fetus in 40% der Fälle das RhD-Antigen nicht exprimierte. Die pränatale Bestimmung des fetalen RhD-Status (NIPT-RhD) ermöglicht den Übergang zu einer gezielten Anti-D-Prophylaxe, welche nur RhD-negative Mütter mit einem RhD-positiven Fetus erhalten. Durch eine Änderung der Mutterschaftsrichtlinien wurde die pränatale Bestimmung des RhD-Status im Jahr 2021 in den Leistungskatalog der gesetzlichen Krankenkassen aufgenommen. Vor dieser Arbeit existierte kein kommerziell erhältliches Testkit, das der erhöhten Nachfrage an pränatalen RhD-Analysen gerecht werden konnte. In einem retrospektiven Teil wurden 707 Patientinnen hinsichtlich des postnatalen blutgruppenserologischen Status der Rh-Antigene RhD, C, c und E der Neugeborenen befragt und das Ergebnis mit dem des nichtinvasiven Pränataltests verglichen. In 185 Fällen wurde das pränatale Ergebnis bestätigt, während ein falsch positiver RhD-Status sowie ein falsch negatives Ergebnis für das Rh-Antigen c festgestellt wurden. Letzteres konnte bei einer Wiederholungsuntersuchung zu einem späteren Zeitpunkt während derselben Schwangerschaft nachgewiesen werden, sodass auch diese Schwangerschaft engmaschig mit Doppler-Sonographie der Arteria cerebri media und Kontrollen des Anti-c-Titers überwacht wurde. In einem prospektiven Teil wurde der fetale RhD-Status durch die Detektion der RHD Exons 5, 7 und 10 mittels des kommerziellen Testkits FetoGnost-Kit-RhD, nach der DNA-Isolation durch den Nukleinsäureextraktor QIAsymphony SP, bestimmt. Die Ergebnisse stimmten in allen 186 Fällen mit einem etablierten Referenztest überein. Im Anschluss wurden die Probandinnen nach dem Ergebnis des blutgruppenserologisch bestimmten postnatalen RhD-Status der Neugeborenen befragt. In einer weiterführenden Untersuchung wurde eine Grundgesamtheit von 1403 Frauen im Alter von 16 bis 47 Jahren (Median: 31 Jahre) betrachtet, die sich zum Zeitpunkt der Blutentnahme zwischen der 9. und 38. Schwangerschaftswoche (Median: 20. Schwangerschaftswoche) befanden. Sie wurden ebenfalls nach dem postnatalen RhD-Phänotyp der Neugeborenen befragt. Von insgesamt 1696 Fällen lieferte die NIPT-RhD 1589 eindeutige Ergebnisse, die sich in 998 RhD-positive und 591 RhD-negative Befunde unterteilten. Aus 523 Rückmeldungen zum RhD-Status der Neugeborenen ergab sich eine Sensitivität von 99,68% (95%-Konfidenzintervall: 98,21% – 99,94%, n = 313) und eine Spezifität von 99,05% (95%-Konfidenzintervall: 96,59% – 99,74%, n = 210). Ein falsch negatives Ergebnis ließ sich möglicherweise auf eine lange Transportzeit von sieben Tagen zurückführen, während zwei falsch positive Ergebnisse aus demselben Testlauf stammten, was die Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination deutlich erhöht. Insgesamt zeigte sich das FetoGnost-Kit-RhD in Kombination mit dem Nukleinsäureextraktor QIAsymphony SP als präzise und für große Probenserien geeignete Methode zur fetalen RhD-Bestimmung ab der 11+0 Schwangerschaftswoche. Hinsichtlich der diagnostischen Genauigkeit zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Schwangerschaftstrimestern. Die Methode erwies sich ab der 11+0 Schwangerschaftswoche als zuverlässig, während sich bei Proben vor der 8. Schwangerschaftswoche Limitationen zeigten. Längere Transportzeiten führten zu einer signifikant höheren Hämolyse-Rate, da 42 von 45 Proben (93,3%) mit Hämolyse eine Transportzeit von über fünf Tagen aufwiesen, und möglicherweise in einem Fall zu einem falsch negativen NIPT-RhD-Ergebnis. Daher wird auf Grundlage der gewonnenen Daten und im Kontext der Literatur eine maximale Transportzeit von fünf Tagen empfohlen. In 1,2% aller Fälle wurden maternale oder fetale RHD Varianten identifiziert. Das Vorhandensein maternaler RHD Varianten wurde zuverlässig erkannt und führte in zwei Dritteln der Fälle zu einem eindeutigen fetalen RhD-Status auf Grundlage der RHD Exons, die in der maternalen DNA fehlten. Spike-Experimente deuteten darauf hin, dass die Multiplex-PCR hierfür ein sicheres Verfahren sein könnte. Ebenso wurden fetale RHD Varianten zuverlässig erkannt, jedoch ermöglichte die verwendete Methode keine eindeutige Aussage zum RhD-Phänotyp und der Immunogenität. Daher wird bei Nachweis einer fetalen RHD Variante eine Anti-D-Prophylaxe empfohlen. Eine Sequenzierung von DNA fetaler RHD Varianten aus maternalem Plasma mittels Next-Generation-Sequencing war nicht erfolgreich. Eine Lagerung von Plasma von Schwangeren erwies sich bei 4°C für bis zu sieben Tage unproblematisch. Zum Zwecke der internen täglichen Qualitätskontrolle und für Ringversuche kann es bei -20°C mindestens 14 Monate sowie bei -80°C über mindestens 25 Monate gelagert werden.