Dissecting STRIPAK-mediated signaling pathways in the ascomycete Sordaria macrospora using proximity-dependent Biotin Identification

Der filamentöse Ascomycet Sordaria macrospora (Sm) dient als Modellorganismus zur Untersuchung der Fruchtkörperentwicklung, um die grundlegenden Prozesse der multizellulären Entwicklung in Eukaryoten aufzudecken. Ein zentraler Regulator dieses Prozesses in S. macrospora ist der Striatin-interagierende Phosphatase- und Kinase-Komplex (SmSTRIPAK). Dieser Multiproteinkomplex ist von Pilzen bis zu Tieren konserviert und fungiert als zentraler Knotenpunkt in der Signaltransduktion, der verschiedene Entwicklungsprogramme durch präzise Phosphorylierung und Dephosphorylierung seiner Zielproteine koordiniert. Dabei geht der SmSTRIPAK-Komplex vorübergehend eine Protein-Protein-Interaktion mit seinen Substraten ein. Die Substrate werden entweder durch seine aktive Phosphatase dephosphoryliert oder durch die rekrutierten Kinasen phosphoryliert. Trotz umfangreicher Forschung ist das zugrunde liegende dynamische Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk des SmSTRIPAK-Komplexes noch nicht vollständig aufgeklärt. Um diese Lücke zu schließen, wurde in dieser Arbeit die Biotin-Identifikationsmethode (BioID) zur proximitätsabhängigen Markierung in S. macrospora unter Verwendung der SmSTRIPAK-Komplex-Interaktor 1 Untereinheit (SCI1) etabliert, um mögliche Substrate des SmSTRIPAK-Komplexes zu identifizieren. Anfangs wurde die TurboID Biotin Ligase für die Markierung benachbarter Proteine verwendet, aber die Methodik wurde durch die Verwendung einer kleineren Ligase-Variante namens miniTurboID erweitert. Durch verschiedene Kontrollen und globale Proteomanalysen von Zellextrakten konnten wir mittels Massenspektrometrie eine signifikante Anreicherung zahlreicher mutmaßlicher Interaktoren des SmSTRIPAK Komplexes aufdecken. Diese Kandidaten zeigen eine deutliche Überschneidung mit Datensätzen aus vorherigen Co-Immunpräzipitations-, Transkriptom- und Proteom-Experimenten, was unseren Ansatz zur Erfassung biologisch relevanter Interaktionen mittels BioID validiert. Die resultierenden Proxiom-Daten unterstreichen die Rolle des SmSTRIPAKs als zentralen Knotenpunkt in der Signaltransduktion während der Pilzentwicklung. Die Daten liefern in vivo Evidenz für die Kolokalisierung des SmSTRIPAK Komplexes mit Proteinen aus anderen konservierten Pilz-Signaltransduktionswegen, darunter das Septationsinitiierungs-netzwerk (SIN), die MAPK-Kaskade des Pheromonsignalwegs (PR), und die Ribosomenbiogenese. Darüber hinaus identifizierten wir das Greenbeard-Protein SmDOC2 als mutmaßlichen SmSTRIPAK-Interaktor. Zur genaueren Untersuchung der Smdoc-Gene in S. macrospora haben wir Deletionsmutanten erzeugt und deren Phänotypen charakterisiert. Die Einzel-Deletionsstämme ΔSmdoc1 und ΔSmdoc2 wiesen schwere Defekte in der Fruchtkörperentwicklung auf, während der Doppel-Deletionsstamm ΔSmdoc1ΔSmdoc2 eine wildtyp-ähnliche Fertilität aufweist. Unsere kombinierten Ergebnisse aus TurboID-basierten BioID Experimenten, Hefe-Zwei-Hybrid Assays und Fluoreszenzmikroskopie mit SmDOC1 und SmDOC2 weisen auf eine enge funktionelle Verbindung der SmDOC Proteine mit Komponenten des PR-Signalwegs hin. Zusammengefasst ergeben diese Ergebnisse ein Modell, in dem die DOC1/2-Proteine einen neuartigen regulatorischen Knotenpunkt bilden, der möglicherweise den STRIPAK Komplex mit dem PR-MAPK-Signalweg während der Pilzentwicklung verbindet.