6-Thioguanin-induzierte Veränderungen am Proteom und deren Abhängigkeit vom Mismatch-Reparatur-Status in Kolonkarzinomzellen

Strukturschäden an der DNA, zu denen auch Fehlpaarungen von Basen zählen, können durch mutagene Einwirkungen oder aber spontan entstehen. Zu einem gewissen Grad können diese vom Mismatch-Reparatur-System (MMR) repariert werden oder aber zum Zelltod führen, welcher unter anderem bei den antineoplastischen Purinanaloga wie 6-Thioguanin (6-TG) eine gewünschte Wirkweise darstellt. Einige Karzinom-Entitäten wie das Kolonkarzinom sind mit einem Funktionsverlust von Proteinen des MMR assoziiert. Unser Ziel war es den Einfluss von MLH1 als einen der Hauptrepräsentanten des Mismatch-Reparatursystems im Hinblick auf das Therapieansprechen von Thiopurinen auf Proteinebene zu untersuchen. Hierzu wurden zwei isogene Zellgruppen der RKO-Zelllinie so etabliert, dass die Wildtype Zellen eine natürliche Defizienz am MLH1 Gen aufwiesen (MLH1–), während einigen von ihnen das Gen wieder ins Genom eingebaut wurde (MLH1+). Beide Zellgruppen wurden dann mit 6-TG behandelt, es folgte ein quantitativer Proteinvergleich mittels zweidimensionale Gelelektrophorese (2DGE). Unterschiedlich regulierte Proteine wurden massenspektrometrisch identifiziert und bezüglich deren Beteiligung an verschiedenen biologischen Funktionen analysiert. Die gefundenen Proteine wurden mit Hilfe der STRING Bioinformatik-Datenbank (www.string-db.org) auf deren Beteiligung an biologischen Prozessen untersucht. Die Etablierung des isogenen Zellpaares, welches sich nur in der Expression von MLH1 unterscheidet, wurde mittels Western Blot nachgewiesen. In der 2DGE ergaben sich insbesondere signifikante Unterschiede in den Gruppen MLH1+ nach 6-TG-Behandlung im Vergleich zu MLH1– nach Behandlung mit 6-TG. Massenspektrometrisch konnte erstmalig auf Proteomebene aufgezeigt werden, welche Proteine sich zwischen den Zellgruppen quantitativ unterscheiden. Durch die Anwendung der STRING-Analyse zeigt sich insbesondere eine Beteiligung in jenen biologischen Prozessen, die im Purinmetabolismus beteiligt sind; darüber hinaus in der Regulation von Zelltod und in biologischen Prozessen, die als Antwort auf oxidativen Stress gedeutet werden können. Da Proteine, die in den Apoptose-Signalwegen involviert sind, vermehrt nach 6-TG-Behandlung besonders bei MLH1+ Zellen zu beobachten waren, wurde die Hypothese aufgestellt, dass durch 6-TG-Behandlung insbesondere bei MLH1+ Zellen ein Zelluntergang induziert wird. Dies wurde mittels Western Blotting mit p53 überprüft und konnte verifiziert werden: es ließ sich ein signifikant erhöhtes Signal bei 6-TG-behandelten MLH1+ Zellen, nicht jedoch bei MLH1– Zellen messen. Ebenfalls mittels Western Blots wurde die Beobachtung verifiziert, dass besonders nach 6-TG-Gabe GSTP1 als eines der Proteine, die in der Antwort auf oxidativen Stress beteiligt sind, hochreguliert wird und dies deutlicher in MLH1– Zellen als in MLH1+ Zellen. Hier besteht weiterer Forschungsbedarf, um diese Beobachtung mit anderen Methoden zu verifizieren und Erklärungen hierfür zu finden. Insbesondere, da eine erhöhte GSTP1-Expression bei mehreren Tumorentitäten mit Therapieresistenz und schlechterer Prognose assoziiert ist. Das Patientenkollektiv, welches bereits somatisch ein defizientes MMR (dMMR) aufweist und eine Indikation für Azathioprin hat, dürfte klein sein. Dennoch könnte es für diese Patienten entscheidend sein eine dMMR zu identifizieren und gegebenenfalls auf alternative Therapien auszuweichen, wie beispielsweise bei Rektumkarzinom-Patienten, bei denen man inzwischen bei dMMR bereits auf die etablierte Erstlinienchemotherapie mit 5-Flurouracil als Antimetabolit verzichtet und stattdessen auf eine Immuntherapie setzt.