Strategies for Virus Control in Sugar Beet - From Natural Resistance to RNA Interference

Die vorliegende Studie zeigt, dass exogene doppelsträngige RNA (dsRNA), die auf bestimmte Regionen des Genoms des Beet mosaic virus (BtMV) abzielt, unter kontrollierten Gewächshausbedingungen eine lokale antivirale Resistenz in Zuckerrüben und einem Modellwirt induzieren kann. Mittels Hochdurchsatzsequenzierung wurden Regionen des Virusgenoms identifiziert, die mit einer starken Produktion kleiner interferierender RNA (siRNA) assoziiert sind. Entsprechende dsRNAs wurden hergestellt und als Blattsprays angewendet. Beide ausgewählten dsRNA-Fragmente reduzierten die Anzahl der infizierten Pflanzen um 80 %, was das Potenzial von dsRNA-Sprays als nicht-transgene Strategie zur Virusbekämpfung bestätigt. Die angewendete dsRNA wurde schnell absorbiert und in den behandelten Blättern zu siRNAs verarbeitet, aber der Schutz blieb lokal begrenzt. In unbehandelten Blättern trat keine signifikante systemische Resistenz auf, was mit früheren Studien übereinstimmt, die zeigen, dass der Phloemtransport von dsRNA im Allgemeinen ineffizient ist, obwohl kleine RNAs systemisch transportiert werden. Ein wirksamer Schutz der gesamten Pflanze erfordert wahrscheinlich Strategien zur Verbesserung der Aufnahme und systemischen Verteilung wie Formulierungen und Adjuvanzien. Auch Umwelteinflüsse schränken die Wirksamkeit von dsRNAs ein. Blattoberflächen, auf denen Nukleasen vorkommen, können dsRNA-Moleküle abbauen, während die Cuticula und die Zellwände als Barrieren wirken. Selbst wenn dsRNA-Moleküle in die Blattoberfläche eindringen können, müssen sie das Zytosol erreichen, um mit dem RNAi-Mechanismus in Wechselwirkung zu treten. Unter Gewächshausbedingungen reduzierte das Besprühen mit dsRNA vor der mechanischen BtMV-Inokulation die Infektion, aber Feldversuche konnten diese Ergebnisse nicht reproduzieren, selbst wenn schützende Formulierungen verwendet wurden. Phloem-begrenzte Viren, wie das Beet mild yellowing virus (BMYV) und das Beet yellows virus (BYV), replizieren sich hauptsächlich in Phloemzellen, was die Anwendung von dsRNA für diese Viren noch schwieriger macht. Kleine RNA-Analysen von BMYV und BYV zeigten signifikante Unterschiede in der siRNA-Produktion und identifizierten potenzielle dsRNA-Zielkandidaten mithilfe von Hotspot-Mapping. Allerdings wurde bisher noch kein Schutz gegen diese auf das Phloem beschränkten Viren erreicht. Die dsRNA wurde unter Verwendung bakterieller Expressionssysteme für Gewächshausversuche hergestellt. Trotz verschiedener Reinigungsschritte und enzymatischer Verdauungen blieben Restverunreinigungen zurück, die möglicherweise die in unseren Experimenten verwendete wirksame Dosierung verringert haben. Eine Verbesserung des Extraktions- und Reinigungsprozesses könnte die Genauigkeit der verwendeten dsRNA-Mengen erhöhen und einen präziseren Vergleich der Wirksamkeit verschiedener dsRNA-Moleküle ermöglichen, insbesondere wenn nur geringe Mengen an dsRNA verwendet werden sollen. Verbesserungen bei der dsRNA-Produktion und -Formulierung könnten die Stabilität, Aufnahme und systemische Verteilung verbessern und damit die Wirksamkeit unter Feldbedingungen erhöhen. Die Verwendung von exogener dsRNA gegen BtMV zeigt zwar unter kontrollierten Gewächshausbedingungen vielversprechende Ergebnisse, hat aber auch ihre Grenzen. Die systemische Verteilung von dsRNA-Molekülen ist eingeschränkt und die Aufnahme kann variieren. Umweltfaktoren wie UV-Strahlung, Regen und mikrobieller Abbau können ebenfalls die Wirksamkeit verringern. Im Gegensatz dazu bietet das transgene Wirts-induzierte Gen-Silencing (HIGS) eine systemische und dauerhafte Resistenz. Dennoch bleibt der Einsatz von exogener dsRNA attraktiv, da sie flexibel einsetzbar ist. Für die praktische Anwendung ist es notwendig, die dsRNA-Zielmoleküle zu optimieren, die Applikationsmethoden zu verbessern und die Wirksamkeit unter realistischen Feldbedingungen zu überprüfen, insbesondere für Viren, die durch Blattläuse übertragen werden. Insgesamt verliehen BtMV-dsRNA-Sprays unter kontrollierten Bedingungen eine lokale antivirale Resistenz und bildeten damit eine Grundlage für die weitere Entwicklung. Die Identifizierung von siRNA-Hotspots ermöglicht die Entwicklung von dsRNA-Kandidaten, während Einschränkungen hinsichtlich der systemischen Bewegung, der Aufnahme und der Wirksamkeit im Feld die Notwendigkeit optimierter Formulierungen und Verabreichungsstrategien deutlich machen. Trotz dieser Herausforderungen ist exogene dsRNA eine vielversprechende Strategie für den integrierten Virenschutz bei Zuckerrüben. Eine dauerhafte Virusresistenz kann auch durch die Einbringung von Resistenzgenen in das Pflanzengenom erreicht werden. Die Züchtung von Resistenzen bietet einen systemischen, vererbbaren Schutz und wird nicht durch Umweltfaktoren beeinflusst. In der Vergangenheit wurde eine gegen BtMV resistente Zuckerrübenlinie identifiziert und das Resistenzgen auf Chromosom 1 kartiert. Aufgrund des Einsatzes von Neonicotinoiden gegen die das Virus übertragenden Blattläuse wurde die Forschung an resistenten Pflanzen jedoch lange Zeit nicht weiterverfolgt. In jüngster Zeit haben regulatorische Beschränkungen für Neonicotinoide die Relevanz der genetischen Resistenz für ein nachhaltiges Virusmanagement wieder in den Vordergrund gerückt. Vergleiche zwischen BtMV-anfälligen und -resistenten Zuckerrüben-Genotypen bestätigten, dass die resistente Linie verzögerte und abgeschwächte Symptome mit einer geringeren Virusakkumulation aufweist. Die Resistenz scheint nicht mit einer verstärkten RNAi einherzugehen, da die siRNA-Profile zwischen den Genotypen ähnlich waren. Verschiedene Gewächshausversuche deuten darauf hin, dass die Resistenz die systemische Ausbreitung des Virus zu begrenzen scheint, ohne die lokale Replikation zu beeinträchtigen. Die Transkriptom-Analyse ergab eine zentrale antivirale Reaktion in beiden Genotypen, wobei bestimmte Gene in der resistenten Linie konstitutiv oder nach BtMV-Inokulation exprimiert wurden. Dazu gehören ribosominaktivierende Proteine, Jacalin-artige Lektine und andere. Ein Homolog des Gens Arabidopsis thaliana restricted tobacco etch virus movement 1 (RTM1), von dem bekannt ist, dass es die Ausbreitung von Potyviren über große Entfernungen blockiert, ohne eine hypersensitive Reaktion auszulösen, erwies sich als starker Kandidat für ein Resistenzgen. Das RTM1-Homolog der Zuckerrübe befindet sich in der Nähe eines Resistenzmarkers auf Chromosom 1, weist konservierte funktionelle Domänen auf und ist in der resistenten Linie konstitutiv hochreguliert. Allerdings ist eine funktionelle Validierung wie Komplementationsassays, Knockdown- oder Überexpressionsstudien erforderlich, die unterschiedliche Vor- und Nachteile haben. Im Allgemeinen würde die RTM-vermittelte Resistenz mehrere Vorteile bieten: Sie begrenzt die systemische Ausbreitung von BtMV ohne hypersensitive Reaktionen und könnte andere Resistenzquellen ergänzen, einschließlich solcher, die auf durch Blattläuse übertragene Viren abzielen, und so eine dauerhafte, mehrschichtige Abwehr bieten. Dieser nicht-kanonische Mechanismus unterscheidet sich von klassischen NB-LRR-Genen und erweitert das Spektrum der genetischen Werkzeuge für die Züchtung virusresistenter Zuckerrübensorten.