Advancements in Purification Process Development for a Therapeutic Replication-Competent Enveloped Virus Particle

Replikationskompetente behüllte Viren sind vielversprechend für den Einsatz in der onkolytischen Virotherapie und als Vektor für Krebsimpfstoffe. Sie verfügen den Wirtszellen-Spezifität und bieten in ihrem Genom Platz für therapeutisches Genmaterial. Ihre Lipidhülle und ihre Größe machen diese Viruspartikel (VP) jedoch empfindlich gegenüber Umweltfaktoren wie pH-Wert, Temperatur und Scherkräften. Dies macht milde und optimierte Bioprozesse erforderlich, um die Partikelintegrität und dadurch die Infektiosität während der Herstellung zu bewahren. Hohe Konzentrationen infektiöser und replikationskompetenter Partikel sind erforderlich, um die gewünschte therapeutische Wirkung auf Tumorzellen zu erzielen. Obwohl neue analytische und präparative Methoden, angepasst für die Anwendung von VP etabliert wurden, gibt es immer noch Wissenslücken und Herausforderungen. Das Wissen über die Bioprozesse wird durch iterative Experimente gesammelt, wodurch Prozesserfahrung aufgebaut wird. Bei VP ist die Übertragbarkeit zwischen Virusstämmen jedoch schwierig, so dass der Wissensgewinn in diesem neuen Bereich kleinteilig ist. Die Auswirkungen von Bioprozessschritten auf die Integrität verschiedener Virusstämme sind komplex und nicht gut verstanden. Außerdem wird die Prozessentwicklung durch den Mangel an schnellen und zuverlässigen Analysemethoden, die eine effiziente Charakterisierung der Prozessschritte ermöglichen, behindert. Dies verhindert technologischen Fortschritt, wie z. B. die mechanistische Modellierung, die eine zuverlässige, tiefgehende Charakterisierung der Prozessschritte erfordert. In dieser Dissertation wird der aktuelle Stand der präparativen Aufreinigungsmethoden für umhüllte VP zusammengefasst und anschlie- ßend Forschungsfortschritte für identifizierte Herausforderungen bei der Partikelquantifizierung und chromatographischen Reinigung vorgestellt. Zunächst bietet ein umfassendes Literatur Review einen Einblick in die Reinigungsprozesse replikationskompetenter umhüllter VP und unterstreicht die Wichtigkeit der Erhaltung ihrer Integrität für sichere und effektive therapeutische Anwendungen. Umhüllte VP bieten Vorteile wie große Genkapazität und Wirtszellen-Spezifität, sind jedoch empfindlich gegenüber Umweltfaktoren was erhebliche Herausforderungen im Bioprozess mit sich bringt. Die Heterogenität der Partikel erschwert die Entwicklung eines universellen Plattformprozesses und erfordert häufig eine de novo Prozessentwicklung für unterschiedliche Virusstämme. In diesem Review werden Reinigunsverfahren hinsichtlich ihres Einflusses auf die Partikelintegrität bewertet, angefangen bei der Zellernte über Zentrifugationsund chromatographische Techniken bis hin zur sterilen Filtration und Lagerung. Ein Schwerpunkt liegt auf Chromatographieschritten, in dem herkömmliche und neu angepasste stationäre Phasen verglichen werden. Konvektiv betriebene Phasen wie Membranadsorber und Monolithen sind für große VP vorteilhaft, da sie keine diffusionalen Einschränkungen aufweisen. Ihr hoher Stoffübergang und niedriger Rückdruck ermöglichen hohe Flussraten ohne Reduktion der Bindungskapazität. Vorund Nachteile sowie bestehende Wissenslücken in der VP-Reinigung werden beschrieben, ebenso wie analytische Lücken, die eine effiziente Bewertung der Partikelqualität und -quantität, und damit die Optimierung der Bioprozessschritte behindern. Die Dissertation geht in Forschungsartikel über, die Fortschritte bei analytischen und präparativen Methoden darstellen. Dabei kam ein modifiziertes Vesicular Stomatitis Virus (VSV) zum Einsatz. VSV ist ein patronen- (engl. “bullet-”) förmiges, umhülltes VP mit Abmessungen von ∼70 nm×∼200 nm. Die entwickelte analytische Methode adressiert den Bedarf an schneller und präziser VP-Quantifizierung, um Massenbilanzen zur Evaluierung von Prozessschritten zu ermöglichen. Vorgestellt wird eine markierungsfreie Methode, basierend auf Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl. “high performance liquid chromatography”, HPLC) und Größenausschlusschromatografie (engl. “size exclusion chromatography”, SEC), gekoppelt mit UV-Detektion für die Partikelquantifizierung. Das Setup ist ergänzt durch einen Mehrwinkel-Lichtstreuungsdetektor (engl. “multi-angle light scattering”, MALS) zur Partikelcharakterisierung welcher zusätzliche Informationen wie Partikelgröße liefert. Die Methode wurde hinsichtlich einer hohen Rückgewinnungsrate der VP von der SEC Säule und dem HPLC System optimiert, um somit Robustheit und Zuverlässigkeit zu garantieren. Der SEC Auschlusspeak wurde mittels offline Analysen und online UV-Detektion als Viruspeak identifiziert, was sich in einem konsistenten UV 260 nm/UV 280 nm-Verhältnis zeigte. Die Methode zeigte hohe Präzision und Robustheit mit einer Reproduzierbarkeitsabweichung von unter 1 % und einer Prä- zisionsabweichung von unter 3 %. Der lineare Quantifizierungsbereich erstreckt sich von 7.1 × 108 bis 1.7 × 1011 VPs mL , mit einem Detektionslimit (engl. “limit of detection”, LOD) von 7.7 × 107 VPs mL und einer unteren Bestimmungsgrenze (engl. “lower limit of quantification”, LLOQ) von 4.2 × 108 VPs mL . Die Quantifizierung erwies sich als unabhängig von der unterschiedlichen Zusammensetzung der Probenmatrix durch die Reinigungsstufen. Während die Methode die Gesamtzahl der VP quantifiziert und eine orthogonal quantifiziertes Referenzmaterial benötigt, liefert sie Ergebnisse am selben Tag mit minimalem Arbeitsaufwand und ermöglicht schnelle Entscheidungen in VP-Reinigungsprozessen. Eine Anwendung für eine Massenbilanz des Chromatographieschrittes eines modifizierten VSV belegte ihre Eignung für Prozesscharakterisierungen und Entwicklung mechanistischer Prozessmodelle. Die anschließende Studie untersuchte spezifisch das Verhalten des modifizierten VSV in einem chromatographischen Reinigungsschritt. Bei der Charakterisierung des Capture-Schrittes mittels einem Kationaustauschchromatografen (engl. “cation exchange chromatography”, CEX) bei Verwendung eines Monolithen wurde ein unerwartetes fluiddynamisches Phänomen festgestellt. Es resultierte in einem Tailing-Effekt und der Trennung von Subpopulationen, welche sich nicht durch gängige chromatographische Prinzipien erklären ließen. Das Phänomen wurde als konvektiver Einschluss (engl. “convective entrapment”, CE) identifiziert, ein Effekt, bei dem große Biomoleküle vorübergehend in Engstellen der stationären Phase eingeschlossen werden. Partikel werden durch Advektion in diese Engstellen gedrückt und können nur durch Diffusion zurück in den Hauptströmungspfad gelangen. Frühere Studien zeigten diesen Effekt bei großen Biomolekülen mit der Auswirkungen von Ertragsverlusten und Verzögerungen in der Elution. Jedoch wurde dieser Effekt in konventionellen mechanistischen Chromatographiemodellen bisher nicht berücksichtigt. Im vorgestellten mechanistischen Modell wird der CE-Effekt mithilfe der Langmuir-Isotherme abgebildet und damit als eigenes Bindungsmodalität, zusätzlich zur elektrostatischen Wechselwirkung nach dem sterisches Massenwirkungsmodell (engl. “steric mass action”, SMA), beschrieben. Simulationen zeigten, dass hauptsächlich eine Subpopulation für das Tailing verantwortlich ist und eine stärkere Retention dem CE zuzuschreiben ist. Das Modell ermöglichte ein besseres Verständnis des präparativen Virusreinigungsprozesses, ist jedoch ohne weitere Entwicklung in seiner Anwendung eingeschränkt. Tailing durch den CE-Effekt ist bei charakteristischen Flussraten in allen Maßstäben zu erwarten, weshalb Ertragsverluste evaluiert und potenzielle Anpassungen der cleaning in place (CIP)-Protokolle geprüft werden sollten. Niedrige Flussraten oder Flusspausen können die Freisetzung der Partikel begünstigen. Zusammenfassend wurde der aktuelle Stand der Reinigungsmethoden für umhüllte VP evaluiert und Fortschritte in der VP-Prozessentwicklung vorgestellt. Das Literatur Review schafft eine Grundlage über den aktuellen Wissensstand und die Herausforderungen von VP-Bioprozessen, insbesondere hinsichtlich der Auswirkungen auf die virale Integrität. Es werden analytische Lücken identifiziert, welche schnelle Prozessentwicklungsiterationen verhindern. Eine dieser Lücken wird durch die Entwicklung einer Quantifizierungsmethode geschlossen, die schnelle und zuverlässige Ergebnisse liefert und die Charakterisierung von Prozessen ermöglicht. Die eingehende Charakterisierung eines präparativen Monolith-Chromatographieschrittes zeigte einen Mangel an Prozessverständnis, der sich in einem nicht erwarteten Tailing-Effekt manifestierte. Das strömungsdynamische Phänomen des convective entrapment wurde zum ersten Mal mit einem mechanistischen Modell dargestellt, das die Bewertung seiner Auswirkungen durch Simulationen ermöglicht. Weitere Studien könnten das mechanistische Modell verbessern, um in silico Optimierungen und eine robuste Herstellung von umhüllten VP zu ermöglichen.