Time-resolved intrinsic fluorescence of tryptophan - from fundamental biophysical understanding to practical applications in pharmaceutical research

Die zeitaufgelöste Fluoreszenzspektroskopie ist eine etablierte Methode, um molekulare Bewegungen und Wechselwirkungen im Nanosekundenbereich aufzuklären. Diese Untersuchungen ermöglichen ein besseres Verständnis darüber, wie biologische und synthetische Wirkstoffe auf ihre Zielstrukturen, z.B. Proteine oder Membranen, wirken. Üblicherweise markiert man den Wirkstoff oder die Zielstruktur in solchen Experimenten mit einem Fluoreszenzfarbstoff. Es gilt zu beachten, dass der Einsatz einer fremden Struktur zwangsläufig das untersuchte System verändert. Im Bereich der pharmazeutischen Forschung können irreführende experimentelle Ergebnisse schwerwiegende Folgen haben: Sie können zu längeren Forschungsphasen und erfolglosen präklinischen Studien führen. Dadurch kann es zu Verzögerungen der Arzneimittelzulassungen führen. Aus diesem Grund ist das Ziel dieser Arbeit, markierungsfreie zeitaufgelöste Fluoreszenzmethoden zu entwickeln, die auf tiefem Verständnis der intrinsischen Fluoreszenz des Tryptophans (Trp) basieren und in der pharmazeutischen Forschung eingesetzt werden können. Der erste Teil dieser Arbeit fasst bereits veröffentlichte Anwendungen von zeitaufgelösten Fluoreszenztechniken mit Trp in pharmazeutischen Wissenschaftszweigen zusammen. Darüber hinaus werden Lösungen und Korrekturen für methodische Herausforderungen angeboten. Zudem werden die Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der mehrdeutigen Interpretation der zeitaufgelösten Spektralverschiebung direkt adressiert. Die Ergebnisse werden in Form eines kritischen Reviews zusammengetragen, sodass es Forschenden, die an der Anwendung von Trp interessiert sind, als Inspiration und praktische Anleitung dienen kann. Im zweiten Abschnitt liegt der Fokus auf der Untersuchung des Verhaltens von vier Analoga des natürlich vorkommenden antimikrobiellen Peptids (AMP) Viscosin. Jedes Analog enthält eine Trp-Einheit, die anstelle einer unpolaren Aminosäure in die Peptidsequenz eingefügt wurde. Membranaktive Substanzen, insbesondere AMPs, sind Hoffnungsträger auf der Suche nach neuen Wirkstoffen gegen pathogene Mikroorganismen und Krebserkrankungen. Für ein detailliertes Verständnis ihres Wirkmechanismus ist es unerlässlich, zunächst die molekularen Eigenschaften des Peptids und der Zielstruktur zu verstehen. In diesem Teil der Arbeit wurde festgestellt, dass sich die Eigenschaften der Trp-Analoga nicht wesentlich von denen des Stammpeptids unterscheiden. Die Ergebnisse zeigen, dass die gewonnenen Informationen sich überwiegend auf die unmittelbare Umgebung von Trp und weniger auf das Verhalten des Peptids als Ganzes beziehen. Dennoch lassen sich aus den Messungen bei vorsichtiger Analyse wertvolle Erkenntnisse über das Verhalten des Peptids gewinnen. Alle Trp-Positionen berichten über die Insertion ihres Peptids in die Membran. Die parallele Analyse von vier Peptidanaloga gibt Auskunft über die Orientierung und die Position des Ursprungspeptids in der Membran. Trp, das sich tief im hydrophoben Bereich der Membran befindet, gibt Aufschluss über die konzertierten Wirkungen des Peptids (wie z. B. die verursachte Membrandurchlässigkeit, die mit biologischer Aktivität korreliert). Im nächsten Abschnitt wurde die zeitaufgelöste Fluoreszenz von Trp untersucht, das natürlicherweise im humanen Serumalbumin (HSA) vorkommt. Angesichts der Fähigkeit von HSA, hydrophobe Arzneimittel und Komponenten ihrer Wirkstoffabgabesysteme zu binden, besitzt es das Potenzial, die biopharmazeutischen Eigenschaften von intravenös verabreichten Formulierungen erheblich zu beeinflussen. Dies spielt eine entscheidende Rolle, wenn es darum geht, schwer lösliche pharmazeutische Wirkstoffe in wässriger Lösung zu halten. Dies ist wiederrum notwendig, um die Aktivität des Wirkstoffs zu gewährleisten und gleichzeitig den Patienten vor möglichen Komplikationen durch Ausfallen des Arzneimittels zu schützen. Nach der Bindung des Modellwirkstoffs ANS an HSA innerhalb der Försterdistanz wurde die Fluoreszenz von Trp durch Energietransfer gelöscht. Die Abnahme von der amplituden-gewichteten mittleren Lebensdauer wurde anschließend mit Hilfe eines neu entwickelten mathematischen Modells angepasst. Dieses Modell berücksichtigt die Bindung von ANS an HSA an zwei Arten von Bindungsstellen, die sich durch ihren Abstand zu Trp unterscheiden. Durch eine globale Anpassung von Titrationen bei verschiedenen HSA- und ANS-Konzentrationen konnten mit diesem Modell thermodynamische Parameter, einschließlich Dissoziationskonstanten und Stöchiometrie, ermittelt werden. Insgesamt bietet diese Arbeit eine Auswahl hochentwickelter Methoden für die markierungsfreie Beobachtung vieler molekularer Eigenschaften von Peptiden und Proteinen, einschließlich ihrer Umgebung. Die entwickelte Methodik kann in einer Vielzahl von Bereichen der pharmazeutischen Forschung angewendet werden. Das gewonnene vertiefte Verständnis der spektroskopischen Eigenschaften der Trp-Fluoreszenz ermöglicht eine sicherere Interpretation der Daten in zukünftigen Studien. Damit kann diese Arbeit als Leitfaden für die Planung von Trp-Fluoreszenz-basierten Experimenten dienen.