Analysis of expression levels and cellular localization of enolase isoforms in reactivated C8D1A astrocytic cells

Astrociti spadajo med celice glije, ki se nahajajo v centralnem živčnem sistemu, kjer imajo pomembno vlogo v homeostazi in pri imunskemu odgovoru. Pod vplivom raznih vnetnih in patoloških stimulusov se lahko astrociti reaktivirajo v vnetni fenotip A1, ki pospešuje vnetne spremembe, ali pa v protivnetni fenotip A2, ki v možganih deluje zaščitno. Nekatere izooblike encima enolaze, ki jih izražajo tudi astrociti, izkazujejo nevrotrofične učinke, ki so pomembni z vidika preprečevanja nevrovnetja in nevrodegenerativnih sprememb, vendar vloga enolaze v astrocitih še ni razjasnjena. V okviru magistrske naloge smo želeli opredeliti ravni izražanja in določiti celično lokalizacijo izooblik enolaze v reaktiviranih astrocitih. Najprej smo postavili celični model reaktiviranih astrocitov z uporabo celične linije astrocitov C8-D1A, kjer je bil cilj pokazati vpliv stimulacije celic C8-D1A z lipopolisaharidom (LPS) in kondicioniranim gojiščem mikroglije BV2 (MCM) na reaktivacijo astrocitov v vnetni fenotip. Pri tem se je izkazal MCM za učinkovitejšega, kar smo pokazali z opazovanjem morfologije celic C8-D1A in vrednotenjem vpliva stimulacije na celično preživetje, hitrost proliferacije in na sproščanje vnetnih mediatorjev v celicah astrocitov. Nadalje smo opredelili raven izražanja in znotrajcelično lokalizacijo α- in γ-enolaze v reaktiviranih celicah C8-D1A. Izpostavitev MCM, ne pa tudi LPS, je povišala izločanje izooblik enolaze z večjim izločanjem izooblike γ, medtem ko se raven znotrajcelične enolaze ni značilno spremenila, kar smo pokazali s testom ELISA. V zadnjem delu magistrske naloge smo vrednotili še vpliv ireverzibilnega zaviralca katepsina X, AMS36, in sinteznih peptidov α- in γ-enolaze na reaktivacijo astrocitov. Pokazali smo, da je AMS36 z zaviranjem katepsina X po izpostavitvi MCM preprečil prehod astrocitov v vnetni fenotip A1, kar se je pokazalo v morfologiji celic in pri upadu aktivnosti kaspaze-3, hkrati pa se je prisotnost zaviralca odražala v povišani ravni aktivne oblike γ-enolaze. Podobne rezultate smo dobili pri poskusih s sinteznimi peptidi, ki posnemajo C-končni del enolaze. Pridobljeni rezultati nakazujejo na pomembno vlogo izooblik enolaze in uravnavanje ravni aktivne oblike γ-enolaze s katepsinom X pri prehodu astrocitov v vnetni fenotip A1, s čimer bi razvoj spojin, ki bi spodbujale nevrozaščitno delovanje α- in γ-enolaze imel doprinos pri terapiji vnetnih in nevrodegenerativnih sprememb v osrednjem živčevju.