Modifications of TDP-43 and FUS proteins under stress conditions

Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) je redka progresivna bolezen motoričnih nevronov z nizko incidenco in visoko umrljivostjo, pri čemer smrt v večini primerov nastopi v treh do petih letih po diagnozi. Na njen nastanek vplivajo spremembe različnih proteinov, ki vzdržujejo celično homeostazo, znane mutacije pa pojasnijo približno 20 % primerov. Med njima sta TDP-43 in FUS, RNA-vezavna proteina s ključno vlogo pri regulaciji izražanja genov, homeostazi in transportu RNA. Za ALS je značilna izguba jedrnega TDP-43 ter pojav fosforiliranih in ubikvitiniranih citoplazemskih agregatov pri približno 97 % bolnikov, medtem ko so spremembe FUS manj pogoste, vendar bolezen pogosto hitro napreduje. V raziskavah bolezensko stanje modelirajo z različnimi molekulami, ki povzročijo oksidativni, hiperosmotski ali Ca2+ -odvisen stres, saj se mehanizmi degeneracije pri patoloških tkivih pogosto razlikujejo, zato en sam pristop ne pojasni variabilnosti bolezni. V ta namen smo celice HEK293 in SH-SY5Y izpostavili D-sorbitolu, NaAsO2 , H2 O 2 in CaCl 2 v akutnih (1,5 h) in kroničnih (24 h) pogojih ter lizate analizirali z 2D elektroforezo, prenosom western in imunodetekcijo. Pri TDP-43 smo zaznali spremembe v izoelektrični točki in pojav dodatnih oblik z drugačno molekulsko maso, vključno s fosforiliranimi, ubikvitiniranimi, glikoziliranimi, fragmentiranimi in agregiranimi oblikami. D-sorbitol je pI znižal, NaAsO 2 in H2 O 2 sta ga zvišala, CaCl 2 pa izrazitih sprememb ni povzročil. Pri FUS je NaAsO 2 spremenil razporeditev oblik in povečal fosforilacijo Y526, D-sorbitol pI ni bistveno spremenil, H2 O 2 ga je povišal, vpliv CaCl 2 pa je bil najmanjši. Pri SH-SY5Y smo z enakimi metodami določili le fosforilirane, glikozilirane in fragmentirane oblike TDP-43, ki so se razlikovale v pI v primerjavi s HEK293, kar nakazuje na vpliv celičnega tipa na odziv na stres. S HEK293 smo fosforilirane oblike TDP-43 določili s protitelesi proti pS369 in pS409/410 ter z alkalno fosfatazo. Fosforilacija teh mest je bila prisotna tudi v nestresnih pogojih pri različnih oblikah proteina in se ob stresu ni spremenila. N-glikozilacijo smo preverili s PNGazo F in konkanavalinom A, vendar je zaradi dvoumnih rezultatov ne moremo potrditi. Določali smo tudi lokalizacijo inducibilno izražanih fuzijskih proteinov mScarletI-myc-TDP-43 wt in N345K v HEK293. Pri akutnem stresu je TDP-43 ostal pretežno jedrn v obliki zrnatih struktur in ni tvoril izrazitih citoplazemskih agregatov, medtem ko so se ti pri kroničnem NaAsO 2 pri manjšem deležu celic z wt obliko proteina pojavili. Rezultati kažejo, da stresor, trajanje izpostavitve in morda celo celični tip določajo oblike TDP-43 in FUS. Ugotovitve usmerjajo raziskave v diferencirane nevrone in patološka tkiva, kjer bo mogoče neposredno povezati modifikacije, lokalizacijo in odziv na stres.