Systematic phenotyping and exome sequencing of children and adolescents with idiopathic short stature

Ozadje: Nizka rast je pogosto pediatrično klinično stanje in eden najpogostejših razlogov za napotitev k pediatričnemu endokrinologu. Kljub obsežnim kliničnim in laboratorijskim preiskavam, vzrok nizke rasti pri večini bolnikov ostaja nepojasnjen (tj., idiopatska nizka rast, angl. idiopathic short stature - ISS). Ker telesno višino uvščamo med najbolj dedne človeške lastnosti, v etiopatogenezi nizke rasti genetski dejavniki igrajo ključno vlogo. Med njimi imajo najizrazitejši vpliv na rast redke monogenske različice v genih, povezanih z rastjo. Namen doktorske disertacije je bila vpeljava naprednejše genetske diagnostične obravnave otrok in mladostnikov z nepojasnjeno nizko rastjo z uporabo tehnologij sekvenciranja naslednje generacije (angl. next-generation sequencing, NGS). Metode: Preiskovanci so bili izbrani glede na vnaprej določene vključitvene in izključitvene kriterije. Vključitveni kriteriji so bili: starost med 3 in 20 let, višina ≤ - 2 standardnih odklonov (SDS) ter podpisana privolitev za genetsko testiranje po poučitvi. Izključitveni kriteriji so zajemali: konstitucionalno nizko rast, pomanjkanje rastnega hormona, genetske sindrome oz. klinična stanja z dismorfnimi znaki, skeletne displazije, sistemske, kronične ali endokrinološke bolezni ter zdravljenje z zdravili, ki vplivajo na rast (npr. glukokortikoidi). Pri bolnikih z ISS je bila kot osnovna laboratorijska metoda izvedena analiza celotnega eksoma (angl. whole exome sequencing, WES). Pri bolnikih z negativnim rezultatom WES in izrazito nizko rastjo smo nadaljevali z analizo celotnega genoma (angl., whole genome sequencing, WGS). Analiza sekvenciranja dolgih odčitkov je bila izvedena v izbranih primerih, kjer je bil tak pristop ocenjen kot ustrezen. Rezultati: Po opravljeni sistematski fenotipizaciji je bilo v raziskavo vključenih 238 preiskovancev, ki so izpoljnjevali vključitvene in izključitvene kriterije. Analiza WES je pri 11% (25/238) dokazala genetski vzrok nizke rasti, pri dodatnih 13 % (32/238) pa je bila opredeljena različica nejasnega pomena (angl., variant of uncertain significance, VUS). Najpogostejši genetski vzrok ISS so predstavljale heterozigotne verjetno patogene (LP)/patogene različice (P) v genu ACAN, ki so bile prisotne v 3%, po pogostosti so jim sledile LP/P različice v genu NPR2 (2%). LP/P različice so bile opredeljene še v genih GHSR, GHR, IGF1R, IGFALS, SHOX, IHH in PTPN11. Pri preiskovancih z ISS z opredeljenim vzrokom nizke rasti smo ugotavljali variabilno klinično sliko. Pojav nepopolne penetrance je bil opredeljen v genih ACAN, NPR2, GHSR in IGFALS. V skupini preiskovancev z ACAN različico smo opisali nove fenotipske značilnosti, kot so otoskleroza ter pojav sklepnih težav v obdobju otroštva. Pri bolnikih z drugačnosmiselno različico c.794G>A (p.Arg265Gln) v genu PTPN11 je bila prisotna izolirana nizka rast. Pri preučevanju učinkovitosti zdravljenja z rastnim hormonom pri nosilcih z ACAN in NPR2 različicami, so rezultati pokazali zmeren, a klinično pomemben odziv, zlasti kadar je bilo zdravljenje uvedeno zgodaj. Preko implentacije bioinformatskega delokroga za identifikacijo različic v številu kopij (angl. copy number variation, CNV) so bile na podatkih WES, ugotovljene tri različice CNV, in sicer v genih ACAN, IGFALS in SHOX, kar predstavlja v primerjavi z ugotovljenimi točkovnimi različicami, manjšino ugotovljenih genomskih različic. Analiza celotnega genoma, ki je bila izvedena pri bolnikih z izrazito nizko rastjo in negativnim rezultatom analize WES, dodatnih vzrokov nizke rasti ni opredelila. Pri izbrani družini z avtosomno dominantnim vzorcem nizke rasti in s kariotipom ugotovljeno inverzijo na kromosomu 2 (inv(2)(p11.2p25.2)), smo za določitev točk loma uporabili metodo sekvenciranja dolgih odčitkov, ki se je v tem primeru izkazala za učinkovito. Z omenjeno metodo smo uspešno identificirali natančne točke loma inverzije, z genomskimi koordinatami 4,606,746 do 82,445,479 (GRCh37). Navkljub identifikaciji točk loma, klinični pomen te strukturne najdbe zaenkrat ostaja nejasen. Zaključek: Namen doktorske disertacije je bil vzpostaviti celovit in napreden diagnostičen pristop h genetski obravnavi otrok in mladostnikov z idiopatsko nizko rastjo, kar predstavlja pomemben napredek pri klinični obravnavi teh otrok v Sloveniji. Na podlagi pridobljenih rezultatov doktorske disertacije smo razvili nov, posodobljen genetski algoritem za obravnavo otrok z ISS in ga vpeljali v rutinsko klinično prakso. Ugotovitve doktorske disertacije so razširile nabor genotipskih in fenotipiskih značilnosti otrok z ISS, kar predstavlja pomemben doprinos k znanosti na tem področju. V doktorski disertaciji smo preučevali tudi odziv na zdravljenje z rastnim hormonom pri preiskovancih z ACAN in NPR2 različicami in ugotavljali v povprečju zmeren, a klinično pomemben odziv na zdravljenje. Ti podatki nakazujejo na pomen pristopov personalizirane medicine, saj bi v prihodnosti v tem primeru lahko genetski profil posameznika pomembno vplival na izbiro terapije ter napoved učinkovitosti zdravljenja.