Establishment of a hop (Humulus lupulus) transformation protocol for target genomerearrangement using CRISPR/Cas9 technology

Magistrsko delo je bilo zastavljeno z namenom vzpostavitve protokola transformacije štirih sort hmelja, 'Celeia', 'Styrian Eureka', 'Styrian Kolibri' in 'Wye target', za tarčno preurejanje genoma s tehnologijo CRISPR/Cas9. Preizkušali smo tri različna gojišča, ki so se razlikovala po vsebnosti in koncentraciji hormonov in tri tipe izsečkov, listni pecelj, internodij in izseček listne ploskve. Pogoji za določanje najboljših kombinacij je bila uspešnost regeneracije, pri čemer smo opazovali tvorbo kalusa, zelenega kalusa ter razvoj poganjkov. Pri iskanju najboljše kombinacije sorte, gojišča in tipa izsečka smo opazili razlike med samo ustreznostjo gojišča in tipa izsečkov glede na sorto. Za največ sort je bilo najbolj primerno gojišče z dodatkom 1 mg/l TDZ in 0,025 mg/l IAA, med izsečki pa je bil najbolj odziven internodijski izseček. Za nadaljni poskus transformacije hmelja smo izločili izsečke listne ploskve, saj je bila njihova regeneracija najslabša, in uporabili izsečke listnega peclja in internodije. Za transformacijo smo nato izbrali po dve kombinaciji gojišča in izsečeka, za vsako sorto, ter izbrane transgene ZsGreen, hptII in Cas9 na plazmidu pHSE-Zsg-sgHlPDS1 vnesli v celice hmelja s pomočjo bakterije Agrobacterium tumefaciens. Med regeneracijo izsečkov smo uspešnost transformacije spremljali z epiflourestentno lupo. Za preverjanje prisotnosti transgenov smo izvedli PCR analizo ter agarozno elektroforezo. Transgen ZsGreen je bil med vsemi transgeni najpogosteje zastopan pri testiranih vzorcih, s kar 90 % prisotnostjo. Pomnožke transgena Cas9 je bilo moč zaznati pri 80 % testiranih vzorcev, transgen hptII pa je bil prisoten pri 65 % vzorcev. Primerjava odstotka regeneracije brez transformacije in po transformaciji je pokazala očitno razliko, saj so se izsečki po transformaciji veliko slabše regenerirali. Z nalogo lahko potrdimo, da je uspešnost transformacije in regeneracije zelo odvisna od same kombinacije sorte, gojišča in tipa izsečka.