Development of a yeast-based platform for bacteriophage applications

O aumento global da resistência aos antibióticos evidencia a necessidade urgente de alternativas eficazes, particularmente contra patógenos gastrointestinais como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus e Clostridioides difficile. Entre as soluções emergentes, as endolisinas de bacteriófagos destacam-se pela elevada especificidade e pelo reduzido impacto sobre a microbiota comensal. As leveduras, em especial a probiótica Saccharomyces boulardii, constituem chassis atrativos para a produção e entrega de endolisinas, combinando segurança, sobrevivência no trato gastrointestinal, benefícios probióticos e potencial para engenharia genética. Nesta tese, ferramentas de CRISPR-Cas9 foram aplicadas para modificar geneticamente estirpes de S. cerevisiae e S. boulardii visando a integração cromossómica e expressão da endolisina anti-Listeria Ply511. Em S. cerevisiae, a secreção de Ply511 revelou atividade antimicrobiana eficaz contra L. monocytogenes, inclusive em matrizes alimentares, ao passo que a sua exibição na superfície não resultou em redução do patógeno. A extensão desta abordagem a S. boulardii demonstrou a capacidade da levedura probiótica de secretar Ply511 com atividade detetável, ainda que inferior a observada em S. cerevisiae. As estirpes modificadas mantiveram efeitos antimicrobianos após digestão gastrointestinal simulada e reduziram L. monocytogenes numa comunidade definida SIHUMI, porém falharam em controlar L. monocytogenes numa simulação colónica in vitro com fezes humanas. A plataforma foi ainda explorada para outros patogénicos Gram-positivos, através da engenharia de S. boulardii para expressar LysSA11, direcionada a S. aureus, e CD27L(1-179), direcionada a C. difficile. A ausência de atividade destas endolisinas evidenciou a complexidade da secreção e da estabilidade, revelando variações dependentes da própria endolisina e do desenho dos peptídos sinal. Em conjunto, este trabalho demonstra a viabilidade da engenharia de leveduras, incluindo a probiótica S. boulardii, para a produção e entrega de endolisinas derivadas de fagos no trato gastrointestinal. Apesar de persistirem desafios relacionados com a eficiência de secreção e a otimização das estirpes, os resultados apresentados estabelecem as bases para o desenvolvimento de sistemas probióticos produtores de antimicrobianos de precisão, contribuindo para alternativas inovadoras aos antibióticos baseadas em fagos.