Charakterisierung der Interaktionen zellulärer Faktoren mit HIV-1 in verschiedenen humanen Makrophagenpopulationen in vitro

In der vorliegenden Arbeit wurde die Infektion und Replikation von HIV-1 in vitro in verschiedenen Makrophagenpopulationen analysiert. Das Verständnis der Interaktionen zwischen Makrophagen (MAK) und HIV-1 ist eine Vorraussetzung für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze bei der HIV-1 Infektion. Es zeigte sich in in vitro Infektionsexperimenten, dass die Virusreplikation in MAK-Kulturen bestimmter Spender unter der Nachweisgrenze liegen kann, während in den Kulturen anderer Spender bereits zu frühen Zeitpunkten nach der in vitro Infektion hohe Virusproduktionen, stattfinden. Die wiederholt in der gleichen Abstufung auftretenden Unterschiede in der Replikationskinetik des primären, M-tropen Isolates HIV-1D117III bei fünf im Detail analysierten MAK-Spendern verdeutlichten, dass die aufgetretenen spenderabhängigen Unterschiede genetisch bedingte Ursachen haben. Die vergleichende Analyse der Anzahl p24- Antigen positiver MAK in den Kulturen konnte die Unterschiede zwischen den Spendern auf der Ebene der produktiv infizierten Zellen ausmachen. Die unterschiedlichen Empfänglichkeiten der Spender-MAK für HIV-1 konnten mittels Titration von HIV-1D117III und dem laboradaptierten Isolat HIV-1AdaM auf den Spender-MAK bestätigt werden, wobei bis zu 3000-fache Unterschiede gemessen wurden. Wie die Untersuchungen der Oberflächenexpression der relevanten HIV-Rezeptoren zeigten, waren keine Unterschiede in der Expression von CD4, CCR5 und CCR3 zwischen den fünf analysierten Spendern festzustellen, die eine unterschiedliche Infizierbarkeit erklären könnten. Auch eine unterschiedliche Sekretion der supprimierend wirkenden β-Chemokine oder anderer modulierender löslicher Faktoren konnte ausgeschlossen werden. Eine leichte Korrelation mit der Infizierbarkeit der MAK konnte nur für das Reifungsantigen CD14 beobachtet werden, sodass sich Anhaltspunkte ergaben, dass MAK von Spendern mit erniedrigter in vitro-HIV-1 Infizierbarkeit sich durch Defizite ihrer in vitro Reifung auszeichnen. Der Nachweis der Bildung der Provirusgenome in den MAK von extrem unterschiedlichen Spendern erfolgte an Hand einer spezifischen PCR-Analyse. Diese konnte aufzeigen, dass zwar noch ähnliche Mengen an frühen DNA-Transkripten während der Reversen Tranksription von HIV-1 in deren MAK synthetisiert wurden, sich jedoch signifikante Unterschiede in der Synthese der „Full length“-Transkripte ausbildeten. Genetisch gesteuerte Faktoren können demzufolge auf der Ebene der Reversen Transkription mit HIV-1 in Wechselwirkung treten. Die vergleichende Analyse der Replikation von HIV-1D117III in serumfrei mit M-CSF gereiften MAK (M-CSF MAK) und mit Serum-gereiften MAK (AB-Serum MAK) zeigte, dass in den AB-Serum MAK eine um bis zu 100-fach gesteigerte Virusproduktion, gemessen als RTAktivität, p24-Antigenkonzentration und Anzahl infektiöser Viruspartikel im Kulturüberstand, stattfindet. Unterschiede in der Gesamtvirusproduktion zwischen M-CSF- und AB-Serum MAK etablierten sich hauptsächlich auf der Ebene der Virusproduktionsrate einer einzelnen infizierten Zelle. In Abhängigkeit vom MAK-Spender konnten jedoch die Unterschiede zusätzlich auf erniedrigte Infizierbarkeiten der M-CSF-MAK oder vermindertes Virusbudding zurückgeführt werden. Zelluläre Faktoren schienen in diesem MAK-Modell an verschiedenen Schritten im Replikationszyklus von HIV-1 einzugreifen. Um den Einfluss von Serumfaktoren auf die verschiedenen Stadien der HIV-Replikation zu untersuchen, wurden MAK während der Reifung, der Infektion und der Virusreplikationsphase unter Serum oder serumfrei mit MCSF kultiviert. Die Virusproduktion in M-CSF MAK war durch die Zugabe von Serum induzierbar; umgekehrt, führte der Entzug von Serum zur Reduktion der Virusreplikation. Ausschlaggebend für die Virusproduktion ist demnach die Mikroumgebung während der Virusreplikationsphase. Aus den Beobachtungen dieser Arbeit lässt sich ableiten, dass im Serum bislang unentdeckte Faktoren vorhanden sein müssen, die direkt in die Virusreplikation eingreifen oder in der Zelle physiologische Vorgänge bewirken, die eine Steigerung der Virusproduktivität nach sich ziehen. Da zwischen AB-Serum- und M-CSF MAK keine Unterschiede im Hinblick auf die Expression von HIV-Rezeptoren, β-Chemokinen oder Cytokinen, die einen Einfluss auf die Infektion und Replikation von HIV-1 in MAK ausüben, gefunden wurden, wurde dieses MAK-Modellsystem genutzt, um über den Vergleich ihrer Genexpression in einer Differentiellen Display-Analyse potentielle neue zelluläre Faktoren zu identifizieren, die bei der HIV-Replikation in MAK eine Rolle spielen. Dabei wurde festgestellt, dass in den M-CSF MAK die Expression von Staf50, einem Interferon (IFN)-induzierten Ringfingerprotein mit inhibitorischem Einfluss auf die HIV-LTR-vermittelte Transkription, im Vergleich zu den ABSerum MAK auf mRNA-Ebene erhöht ist. Eine Behandlung von AB-Serum MAK mit IFN-α, IFN-β oder LPS führte zu einer Aktivierung der Staf50-Expression, wobei die Erhöhung der Expression in diesen MAK-Populationen wiederum mit einer erniedrigten Virusproduktion korrelierte. Somit konnte mit Staf50 ein zellulärer Faktor identifiziert werden, der an der Modulation der HIV-Replikation in MAK beteiligt sein könnte. Weitere Studien müssen nun dessen genaue Regulation und Wirkungsweise auf HIV im MAK-System klären.