Charakterisierung, Solubilisierung und Reinigung des humanen β₂-adrenergen Rezeptors nach heterologer Produktion in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris

In dieser Arbeit wurde der humane β2-adrenerge Rezeptor untersucht. Dieser Rezeptor gehört zur Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) und besitzt als strukturelles Merkmal sieben die Membran durchspannende Helices. Der β2-adrenerge Rezeptor ist in der Zellmembran lokalisiert und kann dort an seiner extrazellulären Seite Hormone als Signalstoffe binden. Dieses extrazelluläre Signal wird ins Innere der Zelle weitergeleitet, indem der Rezeptor mit dem heterotrimeren GTP-bindenden Protein (Gαβγ) wechselwirkt. Dieses G-Protein kann nun seinerseits weitere Effektormoleküle, wie z. B. die Adenylatzyclase aktivieren. G-Protein gekoppelte Rezeptoren sind pharmakologisch von großem Interesse, da sie Zielmolekül für viele Medikamente darstellen. Die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur dieser Rezeptoren ist eine wichtige Voraussetzung für die Herstellung spezifisch wirkender Medikamente. Da die natürlichen Gewebe in den meisten Fällen nicht die nötigen Mengen für eine Strukturanalyse beinhalten, müssen sie in geeigneten Expressionssystemen überproduziert werden. In dieser Arbeit wurden verschiedene Konstrukte des β2-adrenergen Rezeptors mit C- und Nterminalen Fusionen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris exprimiert. Dabei konnten Ausbeuten von bis zu 25 pmol/mg Membranprotein erreicht werden. Neben einer Lokalisation des Rezeptors in der Hefezelle mittels elektronenmikroskopischer Verfahren wurde auch eine Analyse posttranslationaler Modifikationen durchgeführt. Dabei konnte sowohl eine Phosphorylierung als auch eine Palmitoylierung des Rezeptors nachgewiesen werden. Die Produktion des Rezeptors in der Hefe wurde sowohl für die Schüttelkultur als auch im Fermenter optimiert. Dabei konnten Ausbeuten von 8,9 mg Rezeptor pro Liter Kulturvolumen erreicht werden. Für die Isolation der Pichia-Membranen wurde ein Protokoll erarbeitet, das es erlaubt aus einem kg feuchter Zellmasse in kurzer Zeit unter Vermeidung proteolytischen Abbaus bis zu 12 g Membranen zu erhalten. Die anschließende Solubilisierung des Rezeptors mit nDodecyl-β-D-maltosid konnte mit einer Ausbeute von nahe zu 100 % durchgeführt werden. Zum Zweck der Reinigung wurden verschiedene Rezeptorfusionen eingesetzt. Neben dem Flag-Anhängsel, dem „green fluorescent protein“ (GFP) aus Aequorea victoria und der Biotinylierungsdomäne der Transcarboxylase aus Propionibacterium shermanii kam noch ein Dekahistidin-Anhängsel zum Einsatz. Im Zuge dieser Arbeit stellte sich heraus, dass das GFP für die Lokalisation, die Solubilisierung und die Reinigung des Rezeptors ein wertvolles Hilfsmittel darstellt. So konnten z. B. durch Fluoreszenzuntersuchungen festgestellt werden, dass ein großer Teil des solubilisierten Rezeptors von der Alprenolol-Sepharose-Matrix absorbiert wurde und nur noch unter denaturierenden Bedingungen eluiert werden konnte. Die Charakterisierung des Rezeptors mit Dekahistidin-Anhängsels zeigte, dass die Kex2- Prozessierung des Rezeptors durch dieses Anhängsel grundlegend verbessert werden konnte. Bei der Analyse der Biotinylierungsdomäne konnte für den β2-adrenergen Rezeptor in P. pastoris eine Biotinylierung von 90,5 % nachgewiesen werden. Nach verschiedenen Versuchen zur Anreicherung des Rezeptors durch Affinitätschromatographie zeigte sich, dass durch eine Zweischrittreinigung, bestehend aus immobilisierter Metallchelat-Affinitätschromatographie und einer monomeren Avidin-Säule, eine effiziente Reinigung erreicht werden konnte. Die Ausbeute betrug 43 % bei einer spezifischen Aktivität von 12,6 nmol/mg Membranprotein. Die während der Reinigung auftretenden Probleme der Aggregation des Rezeptors konnten gelöst werden. Im Zuge der ersten 2D-Kristallisationsversuche wurde eine funktionelle Rekonstitution des Rezeptors in Lipidvesikel erreicht werden. Dabei lag die Wiederfindung der Rezeptorbindung bei 54 %.