Korrelation von genotypischen Mutationsmustern in der reversen Transkriptase von humanen Immundefizienzviren Typ 1 (HIV-1) mit phänotypischer Resistenz gegen reverse Transkriptase-Inhibitoren bei antiretroviral behandelten und unbehandelten HIV-1-infizierten Patienten : Aufbau und Auswertung der Frankfurter Datenbank

Das Ziel einer optimalen antiretroviralen Therapie bei HIV-1 infizierten Patienten ist das möglichst lange Aufrechterhalten der asymptomatischen Phase der HIV-1 Infektion. Neben anderen Laborparametern ist die Bestimmung der Viruslast im Blut des Patienten als Surrogatmarker für einen Therapie-Erfolg entscheidend. Die maximale Unterdrückung der Viruslast durch Unterbindung der viralen Replikation zeigt eine optimale Therapie an. Zur Zeit sind Inhibitoren für zwei virale Enzyme, die im Replikationszyklus von HIV-1 eine elementare Rolle spielen, im klinischen Einsatz. Die Reverse Transkriptase wird mit Hilfe der Nukleosidalen Reverse Transkriptase-Inhibitoren (NRTI) und der Nicht-Nukleosidalen Reverse Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI), die virale Protease durch den Einsatz von Protease-Inhibitoren (PI) gehemmt. Durch den Einsatz von mindestens drei Medikamenten aus mindestens zwei verschiedenen Substanzklassen wird dieses Ziel bei einem großen Teil der behandelten Patienten erreicht. Mögliche Ursachen für ein Therapieversagen sind beispielsweise fehlende Compliance des Patienten, Nebenwirkungen der Therapie, zu niedrige Plasmaspiegel der Medikamente sowie zelluläre Faktoren wie reduzierte Aktivierung oder vermehrter Rücktransport der Stoffe aus der Zielzelle. Einige der erwähnten Ursachen (Compliance, Plasmaspiegel) führen indirekt zu einer Resistenzentwicklung, die neben den oben angegebenen Punkten ebenfalls ein Therapieversagen bewirkt. Die Resistenzentwicklung wird mit zwei unterschiedlichen Methoden gemessen, zum einen wird der Phänotyp, zum anderen der Genotyp bestimmt. Eine phänotypische Resistenzbestimmung gibt Aufschluß über das in vitro-Replikationsverhalten des Virus in Gegenwart oder Abwesenheit von Medikamenten. Dabei kommen Vollphänotypisierungen sowie Rekombinante Virus Assays zum Einsatz. Der zur Zeit dabei am häufigsten benutzte Test ist das Rekombinante Virus Assay der Firma Virco (AntivirogramTM). Dabei wird nicht das komplette Patientenvirus analysiert, sondern der Genabschnitt mit der viralen Protease und der Reversen Transkriptase aus den Patientenviren mit einem Laborvirus, dem dieser Genbereich deletiert wurde, rekombiniert und getestet. Die antiretroviralen Medikamente werden in diesem Assay in verschiedenen Konzentrationen eingesetzt und über einen Vergleich mit einem Laborvirus eine x-fache Resistenz bestimmt (entspricht dem Quotienten aus der 50% inhibitorischen Konzentration (IC50) des rekombinanten Virus und des Laborvirus). Auch wenn das getestete Virus nicht komplett ist, stellt diese Methode doch eine recht gute Annäherung an die Klinik mit gut interpretierbaren Resultaten dar. Die Nachteile liegen jedoch in der sehr aufwendigen Laborausstattung (Sicherheitsstufe 3) sowie in den Kosten und dem Zeitaufwand (4-6 Wochen bis zum Befund). Die Bestimmung des Genotyps erfolgt meistens über die Sequenzierung des entsprechenden Genabschnitts. Bei der Auswertung der Nukleinsäure-Sequenz werden bestimmte Punktmutationen analysiert, die mit einer phänotypischen Resistenz gegenüber einzelnen Medikamenten korreliert sind. Der Vorteil dieser Methode liegt darin, daß zum einen im wesentlichen die Laborausstattung nur einem molekularbiologischen Labor für die Polymerase Kettenreaktion (PCR-Labor) entsprechen muß, zum anderen sowohl Kosten als auch Zeitaufwand um die Hälfte reduziert sind. Allerdings ist die Interpretation eines Genotyps nicht unbedingt einfach. Die möglicherweise komplexen Wechselwirkungen von Punktmutationen untereinander sowie die Möglichkeit der Unkenntnis von weiteren noch nicht charakterisierten Mutationen erschweren die Interpretation der genotypischen Daten. Interpretationsprogramme und die Auswertung von Genotyp-Phänotyp-Datenbanken unterstützen bzw. ermöglichen die Auswertung des Genotyps. In der vorliegenden Arbeit wird eine solche Genotyp-Phänotyp-Datenbank aufgebaut. Dazu wird eine Genotypisierung etabliert, der Genotyp aus Virusisolaten von Patienten bestimmt und mit phänotypischen Daten aus der klinischen Routine (Antivirogram) verglichen. Im Rahmen der Auswertung werden Analysen in bezug auf Qualität der Datenbank anhand von bekannten Resistenzmutationen und Charakterisierung neuer Polymorphismen durchgeführt. Die Korrelation von bekannten Punktmutationen in der Reversen Transkriptase von HIV-1 mit phänotypischer Resistenz gegenüber Reversen Transkriptase-Inhibitoren in der Frankfurter Datenbank entspricht den bisher publizierten Daten. Für Zidovudin und Abacavir kommt es bei Anhäufung von resistenzassoziierten Mutationen zu einer Erhöhung der phänotypischen Resistenz, das Vorhandensein der Schlüsselmutation für eine Lamivudin-Resistenz korreliert mit dem Phänotyp, bei Didanosin und Zalcitabin ist das, in Übereinstimmung mit Literaturdaten, nicht der Fall. Die in vitro mit einer Stavudin-Resistenz korrelierte Schlüsselmutation ist in klinischen Proben sehr selten und nicht mit einer phänotypischen Resistenz korreliert, das gleiche Resultat ergibt die vorliegende Auswertung. Der Multidrug-Resistenz-Charakter der Q151M-Mutationsmuster ist in der Frankfurter Datenbank ähnlich ausgeprägt wie in den bisher publizierten Studien. Die vorliegenden Ergebnisse aus der Frankfurter Datenbank haben zur Charakterisierung von drei neuen Polymorphismen beigetragen. In Zusammenarbeit mit der Firma Virco wurde ein neues Mutationsmuster für eine gemäßigte Lamivudin-Resistenz unabhängig von der M184VMutation beschrieben. Die Kombination der E44D/A-Mutation mit der V118I-Mutation wird nicht unter Lamivudin- sondern unter Zidovudin-Therapie selektiert und führt zu einer Lamivudin-Resistenz, die deutlich weniger ausgeprägt ist als die durch die M184VSchlüsselmutation verursachte Resistenz. Die 6 bp-Insertion zwischen Position 67 und 70 in der Reversen Transkriptase wurde ebenfalls in Zusammenarbeit mit Virco als neues Multidrug-Resistenz-Pattern beschrieben. In der Regel ist die 6 bp-Insertion in Kombination mit Zidovudin-Resistenz assoziierten Mutationen zu finden und führt wie das Q151M-Mutationsmuster zu einer Kreuzresistenz gegenüber allen Nukleosidalen Reverse Transkriptase-Inhibitoren. Besonders ausgeprägt ist in der Frankfurter Datenbank der MDRCharakter der 6 bp-Insertion in Kombination mit der A62V-Mutation. Das dritte neue Mutationsmuster ist eine Dreifachkombination aus der H208Y-, R211K- und der L214FMutation. Diese Kombination verstärkt bei einem Virusisolat, in dem schon mehrere Zidovudin-assoziierte Mutationen vorhanden sind, die Zidovudin-Resistenz. Diese Beobachtung wurde sowohl in Zusammenarbeit mit Virco in vitro als auch in der Frankfurter Datenbank bestätigt. Interessant ist dabei vor allem die Rolle der H208Y-Mutation. Wie oben erwähnt, wird bei einem Zidovudin-resistenten Virusisolat die Zidovudin-Resistenz durch die Kombination H208Y/R211K/L214F erhöht, während die Kombination H208Y/Q161L die Zidovudin-Resistenz erniedrigt. Diese Ergebnisse sowie die Auswertung des reduzierenden Einflusses der M184V-Mutation auf die Zidovudin-Resistenz machen die Problematik der Wechselwirkungen von Mutationen deutlich. Ein weiteres Problem bei der Interpretation genotypischer Daten ist die Kreuzresistenz von Mutationen. In der vorliegenden Auswertung werden die Kreuzresistenz der M184V-Mutation, der Zidovudin-assoziierten Mutationen und der mit einer Resistenz gegenüber NichtNukleosidalen Reverse Transkriptase-Inhibitoren (NNRTIs) assoziierten Mutationen analysiert. Während in vitro eine Kreuzresistenz der M184V-Mutation gegenüber Lamivudin, Didanosin und Zalcitabin beschrieben ist, kommt diese klinisch nur eingeschränkt vor, was durch die Ergebnisse der Frankfurter Datenbank trotz fehlender Unterteilung nach Vortherapie der Patienten nachgewiesen werden kann. Eine publizierte Auswertung eines Teils der Daten, bei der nach Vortherapie unterteilt wird, macht diesen Trend deutlicher. Auch bei der Auswertung der NNRTI-Kreuzresistenz ist ein Teil der Daten in einer detailierten Analyse publiziert worden. Die Kreuzresistenz der K103N-Mutation für alle NNRTIs sowie die Wirksamkeit von Efavirenz bei Vorhandensein der Y181C-Mutation wird durch die Auswertung der Frankfurter Datenbank bestätigt. Bei dem Versuch der Korrelation von Stavudin-Resistenz mit genotypischen Mutationsmustern kann gezeigt werden, daß entweder die oben erwähnten Multidrug-Resistenz-Muster oder aber die Zidovudin-Mutationen für eine Stavudin-Resistenz verantwortlich sind. Ebenso kann gezeigt werden, daß diese Isolate auch eine höhere Didanosin- und Zalcitabin-Resistenz aufweisen als Proben ohne die Zidovudin-Mutationen. Insgesamt liefert die Auswertung der Frankfurter Datenbank zahlreiche Hinweise zur Optimierung und Verbesserung der Interpretation von genotypischen Mutationsmustern zur Beurteilung einer phänotypischen Resistenz gegenüber antiretroviralen Medikamenten. Die publizierten Daten sind bei der Erstellung von Richtlinien zur Interpretation sowie bei der Entwicklung von computergestützten Interpretationsprogrammen zum Einsatz gekommen. Das ständige Anwachsen der Datenbank wird auch in Zukunft die Charakterisierung und die Publikation neuer Polymorphismen ermöglichen.