Optimisation of genetically engineered strains of Streptomyces rimosus for heterologous protein production by random mutagenesis and selection approaches

V obsegu magistrskega dela smo optimizirali produkcijski sev Streptomyces rimosus z uvajanjem naključne mutageneze in vzpostavitvijo presejalnega testa za hitro izbiro visoko-produktivnih klonov. S pomočjo elektroporacije smo v sev S. rimosus ATCC deltaOTC soft vnesli plazmidni vektor pAB04_Per, ki nosi zapis za proteazo pernizin in na osnovi azokazeinskega testa izbrali najboljše transformante. Seve S. rimosus ATCC deltaOTC soft, ki nosijo zapis za proteazo pernizin ali za fuzijski proteinski kompleks mCherry-kaminizin, smo testirali v različnih produkcijskih gojiščih. V nadaljevanju smo izvedli mutagenezo s pomočjo UV-svetlobe in etil metansulfonata ter vzpostavili knjižnice mutant sevov S. rimosus ATCC deltaOTC soft, postopek gojenja in presejanja pa smo prenesli v manjše merilo (mikrotitrske plošče), kar je omogočilo hitrejše testiranje. Encimsko aktivnost mutant smo vrednotili z azokazeinskim testom in fluorescenco proteinskega kompleksa mCherry-kaminizin. Najvišje proteolitične aktivnosti v kulturi sevov smo dosegli pri izolatih, ki nosijo zapis za biosintezo pernizina, pridobljenih po izpostavljenosti UV-svetlobi in sicer je aktivnost znašala v povprečju približno 1750 U/mL, kar je 2x več v primerjavi s kontrolnim sevom. Pri izolatih, ki nosijo zapis za proteinski kompleks mCherry-kaminizin, izboljšav v proteolitični aktivnosti nismo zaznali. Opazili smo tudi, da merjenje fluorescence mCherry ni zanesljiva metoda za hitro kvantifikacijo proteolitične aktivnosti v manjšem merilu. Podrobnejša analiza encimskih aktivnosti v kulturah 191 klonov izbranega seva, izoliranih po UV-mutagenezi, je pokazala veliko variabilnost v aktivnosti pernizina, vendar najboljši kloni statistično v proteolitični aktivnosti niso presegli kontrolnega seva, ki ni bil tretiran z mutagenom. Naši rezultati potrjujejo uporabnost naključne mutageneze v kombinaciji z optimizacijo gojišč in presejanjem kot strategije za povečanje aktivnosti produkta pri Streptomyces rimosus. Hkrati pa naši rezultati kažejo, da so potrebne nadaljnje izboljšave v postopku gojenja sevov za stabilnejšo selekcijo visoko-produktivnih sevov za zagotovitev višjih aktivnosti proteaz pernizin in kaminizin.