Rational protein engineering strategies for the development of novel therapeutics in Hemophilia

L’emostasi è un processo fisiologico altamente conservato, essenziale per mantenere la fluidità del sangue e prevenire la perdita ematica mediante la formazione di un coagulo di fibrina stabile, che dipende dall'interazione tra endotelio vascolare, piastrine, fattore von Willebrand (vWF) e fattori della coagulazione (1,2). Le carenze dei fattori VIII (FVIII) o IX (FIX), responsabili rispettivamente dell’emofilia A (HA) e dell’emofilia B (HB), compromettono questo equilibrio e determinano una predisposizione cronica al sanguinamento (3,4). Sebbene la terapia sostitutiva con concentrati di fattori della coagulazione rappresenti il trattamento di riferimento, permangono importanti limitazioni quali la breve emivita plasmatica, la necessità di infusioni frequenti e lo sviluppo di alloanticorpi neutralizzanti (inibitori) (5,6). Questa tesi esplora due strategie distinte di ingegneria proteica per affrontare tali sfide terapeutiche: i) lo sviluppo di una variante di FIX a emivita prolungata (EHL) per pazienti senza inibitori e ii) la progettazione di un nuovo agente di bypass per pazienti con inibitori. Nel primo progetto è stato generato un pannello di varianti iperattive di FIX-Padua (R338L) fuse a una variante di albumina umana ingegnerizzata (HSAQMP) con maggiore affinità per il recettore neonatale Fc (FcRn). Le proteine di fusione sono state ulteriormente modificate in posizione K5 nel dominio Gla del FIX per modulare l’affinità per il collagene di tipo IV (Col4). La caratterizzazione in vitro ha confermato l’attività coagulante e il corretto processamento proteolitico, oltre a una superiore interazione con FcRn. Gli studi farmacocinetici in modelli murini (Tg32, Balb/c e F9 KO) hanno dimostrato che la variante HSAQMP prolunga l’emivita plasmatica grazie a un riciclo più efficiente mediato da FcRn. Nei topi HB, la variante dotata di maggiore affinità per il Col4, ha mostrato un’emivita più lunga, maggiore accumulo nei tessuti ricchi di Col4 e un’efficacia emostatica persistente fino a 96 ore dopo una singola somministrazione. Questi dati evidenziano il ruolo chiave dell’accumulo extravascolare del FIX nel prolungare la sua funzione in vivo. Nel secondo progetto è stato ideato un nuovo agente di bypass basato sul fattore X (FX), ingegnerizzato a livello del suo peptide di attivazione con sequenze derivate dal FIX, per consentire l’attivazione diretta da parte del FXIa conservando l’attivazione attraverso le vie fisiologiche. Le varianti principali, FXBP4b e FXBP4c, espresse e purificate da cellule umane, sono state attivate efficacemente da FXIa pur conservando la capacità di essere attivate da FVIIa/TF e FIXa. In plasmi carenti di FVIII o FIX, entrambe le varianti hanno normalizzato i tempi di coagulazione e ripristinato la generazione di trombina in modo dose-dipendente, confermandone l’efficacia come agenti di bypass. In particolare, FXBP4b ha significativamente abbreviato i tempi di coagulazione in campioni di plasma di pazienti con HA e HB ad alto titolo di inibitori, mostrando attività paragonabili agli agenti di bypass attualmente disponibili. Ciò ne evidenzia il potenziale come agente universale, in presenza o assenza di inibitori. Nel complesso, questi risultati dimostrano il potenziale dell’ingegneria proteica nel migliorare la funzione dei fattori della coagulazione attraverso la modulazione di specifiche interazioni molecolari, come il legame FIX–Col4 per la biodistribuzione e la modifica del peptide di attivazione del FX per un controllo mirato dell’attività. Le strategie descritte rappresentano un passo verso la prossima generazione di terapie emostatiche di precisione, con l’obiettivo di aumentare l’efficacia della terapia sostitutiva e sviluppare approcci di bypass più sicuri e controllabili per i pazienti con inibitori. Gli studi futuri saranno dedicati alla validazione in vivo e all’ottimizzazione farmacocinetica di queste varianti innovative.