Immune mechanisms in development of solid tumors: focus on inflammasome-3 modulation

La malignità dipende da cellule tumorali e infiltranti che formano un peculiare microambiente. L’infiammazione s’innesca a livelli omeostatici ma, quando eccessiva e duratura, esita in immunotolleranza con massiccio reclutamento di leucociti che promuove la crescita tumorale. NLRP3 ha ruolo chiave nell'assemblaggio dell'inflammasoma-3 per la maturazione/secrezione di IL-1β/IL-18. P2X7R rileva livelli elevati di eATP portando ad afflussi (Ca2+/Na+) e efflussi (K+) attivando NLRP3. Con l’infiammazione, P2X7 e NLRP3 co-localizzati sulle MAMs agiscono in sinergia mentre la proteina PML ne riduce l’interazione mitigandone gli effetti. Per definire questa liaison infiammatoria e gli effetti sullo sviluppo di tumori solidi, topi femmina C57BL/6 wt e PML-/- sono stati così trattati: A) 106 cellule di melanoma B16-F10 sono state iniettate s.c. e i tumori prelevati 14 gg. dopo, fissati in Bouin e inclusi in paraffina. Sezioni istologiche (6 μm) sono state colorate con ematossilina/eosina (H/E) o con ABC-immunoperossidasi intensificata con nichel (IHC) mediante anticorpi (P2X7, NLRP3, IL-1β, CD2O6, CD3ε). I tumori sono stati analizzati anche dopo radioterapia a singola dose (2 o 10 Gy). In topi PML-/- non irradiati sono stati rilevati maggiore crescita tumorale, reclutamento di cellule infiammatorie e polarizzazione M2 (immunotolleranza) che in controlli wt. In modo inatteso, sia in topi PML-/- e wt irradiati 2 Gy gli infiltrati infiammatori (M2) sono stati maggiori vs. i controlli, mentre la crescita tumorale è ridotta solo nei wt. Diversamente, l'irradiazione 10 Gy ha ridotto crescita tumorale e infiammazione in entrambi i gruppi. B) Un modello di colite è stato indotto con 2.5% destrano sodio solfato (DSS; 7 gg. ad libitum in acqua da bere seguiti da 3 gg. di sospensione). Al giorno 10, gli intestini (dal cieco al retto) sono stati prelevati, fissati e inclusi e le sezioni colorate con H/E o IHC (PML, P2X7, NLRP3, IL-1β, F4/80, iNOS, CD206, CD3ε). Uno score istopatologico ha rivelato chiara infiammazione nel gruppo wt trattato, aggravata nei topi PML-/- associata a sovra-espressione di proteine infiammatorie. C) Un modello di carcinoma colo-rettale (CRC) è stato indotto con azossimetano (7.4 mg/kg i.p.) seguito da DSS 2.5% in acqua da bere per 3 cicli di 5 gg. alternati a 14 gg. di sospensione. Gli intestini sono stati campionati e processati e le sezioni colorate con H/E o IHC (P2X7, NLRP3, IL-1β, F4/80, iNOS, CD2O6, PCNA). Lo score ha rivelato iperinfiammazione nel gruppo wt trattato, aggravata nei topi PML-/-, associata a sovra-espressione di proteine infiammatorie. D) Un altro modello di CRC è stato indotto con iniezione intracecale di 2x106 cellule MC38 (cancro colon murino). I tumori sono stati rimossi dopo 28 gg. e le sezioni colorate con H/E o IHC (PML, P2X7, NLRP3, IL-1β, F4/80, iNOS, CD206). Nei topi PML-/- i tumori hanno mostrato maggior infiltrato infiammatorio periferico e polarizzazione M2 rispetto ai wt. Gli esperimenti A-D hanno studiato l'assenza di PML nell'ospite, mentre l'uso di cellule MC38 PML-/- (clone selezionato dopo CRISPR-Cas9) in topi wt ha indagato la mancanza di PML nelle cellule tumorali. E) Tumori sono stati raccolti e processati per colorare sezioni con H/E o IHC (P2X7, NLRP3, IL-1β, F4/80, iNOS, CD206). I tumori generati da cellule PML-/- hanno mostrato maggiore infiltrato infiammatorio periferico (principalmente M2) rispetto a quelli da cellule PML+/+. In sintesi, è emersa la rilevanza di PML nella regolazione di NLRP3 e nella progressione tumorale (nel microambiente e nelle cellule tumorali). Infine, ricerche in corso su lamantini selvatici (a Jacksonville Univ, US) mirano a correlare tramite bioinformatica (Kbase, R) espressione di PML, P2X7 e NLRP3 (trascrittomi da sangue intero), stato di salute (via ispezione e analisi del sangue) e stress ambientale (attività umane, cambiamenti dell'habitat).